突变型MMLV逆转录酶、编码基因、表达载体、宿主菌及其应用的制作方法

本发明专利涉及一种突变型mmlv逆转录酶、编码基因、表达载体、宿主菌及其应用，属于生物。

背景技术：

1、逆转录酶(reverse transcriptase)，是以rna为模板合成dna的聚合酶的统称，是科学研究和医学检验分析中常用的工具酶，在现代生物技术领域发挥着重要作用，被广泛应用于转录组分析、病原体检测等各种场景。迄今为止，发现的逆转录酶有数十种，常用的逆转录酶有来自莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，mmlv)的逆转录酶、来自人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv)1型的逆转录酶和来自禽类白血病病毒(avian leukemia virus，amv)的逆转录酶，其中，鼠白血病病毒逆转录酶因其单亚基、逆转录效率较高等优势得到更广泛的应用和更好的商业化。

2、mmlv逆转录酶在1970年发现，被证实具有依赖rna模板的dna聚合酶活性(rna-dependent dna polymerase，rddp)、依赖dna模板的dna聚合酶活性(dna-dependent dnapolemerase，dddp)、降解rna-dna杂合链中rna的rnase h活性和不依赖模板的末端转移酶活性。根据不同需求，不同应用场景对这几个活性的要求也不一样。比如为了获得更好的稳定性和产物完整度，rnase h活性在大多数应用中都被缺失。dddp在一些应用中被提高用来获得更高的逆转录效率和更多的产物，比如在低模板逆转录反应中。

3、而在转录组链特异性测序中，要求准确分析rna来源于基因组的正义链还是反义链，因此在逆转录过程中，需严格要求只合成一链cdna以保留rna的方向性。目前现有的适用于链特异性测序的mmlv逆转录酶产品，通常需要额外添加抑制剂比如放线菌素d来抑制二链cdna的合成，而这将带来更高的成本和不确定性。在单细胞转录组测序中，细胞中的基因组dna会对逆转录反应造成干扰，在逆转录产物中引入基因组信息，虽然可以通过使用dnase来消化基因组dna，但引入的dnase去除又是一个复杂的问题，步骤繁琐且去除不干净会对后续实验造成影响。如果逆转录酶能区分rna模板和dna模板，并且只以rna为模板进行逆转录反应，则可以很好的解决基因组dna污染的问题。

4、因此，亟需一种依赖dna的dna聚合酶活性极低甚至是缺失的逆转录酶，来弥补当前应用的不足，降低成本与风险。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种突变型mmlv逆转录酶，具有降低甚至是缺失的dddp活性。

2、本发明采用的技术方案为：一种突变型mmlv逆转录酶，其在氨基酸序列seq idno.1所示的野生型mmlv逆转录酶进行突变以降低其dddp活性，所述突变型mmlv逆转录酶的dddp活性在野生型mmlv逆转录酶的dddp活性的30％以下。

3、优选的，突变型mmlv逆转录酶具有rddp活性，且rnase h活性缺失。

4、优选的，所述突变型mmlv逆转录酶还具有以下一个或至少两个特性的提高：热稳定性、灵敏度、在rt-qpcr或rt-lamp中与其他聚合酶的兼容性。

5、优选的，突变位点至少包括以下位点中的一个：e7、k120、p141、g178、l217、d224、p297、c310、d361、l362、t382、h438、q461、e489、a536、e562、q568、r657，且与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列一致性在90％以上。更优选的，与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列一致性在95％以上。更优选的，与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列一致性在98％以上。在一些实施例中，突变位点至少包括以下位点中的一个：k120、g178、l217、q461、a536、q568。

6、优选的，突变位点还包括以下位点中的至少一个：t24、m39、s56、s60、m66、p100、p111、p127、l139、k152、e176、m177、f199、d200、a259、t287、t306、g308、f309、t330、l333、w388、d449、l452、s453、t458、h459、n479、l491、a502、h503、g504、d524、h594、l603、l604、t605、s606、e607、g608、i611、d615、h634、i661、t662、l671。

7、优选的，突变位点至少包括以下突变中的一个：e7a或e7g、k120d或k120e、p141l、g178c、l217p、d224g、p297s、c310y、d361g、l362p、t382a、h438r或h438k、q461r或q461k、e489g、a536t、e562g、q568r或q568k、r657c，且与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列一致性在90％以上。

8、优选的，突变位点还包括以突变下中的至少一个：t24a、m39v、s56a、s60r、m66l、p100a、p111l、p127s、l139p、k152d或k152e、e176s、m177i、f199l、d200n或d200h、a259t、t287a、t306a、g308d、f309s、t330p、l333p、w388r、d449g或d449s、l452c、s453r、t458a、h459r或h459k、n479d、l491p、a502v、h503r或h503k、g504s、d524a、h594k、l603w、l604d或l604n或l604y、t605i或t605v或t605f、s606f或s606h或s606y或s606l、e607g、g608s、i611r、d615g、h634y、i661t、t662a、l671p。

9、优选的，所述突变型mmlv逆转录酶的突变位点包含以下组合中的至少一个：

10、(1)l139p/k152e/t382a/g504s/d524a/l604d；

11、(2)k120e/g308d/d524a/l604y/t605v/s606h；

12、(3)k152e/l333p/t382a/g504s/d524a/t662a

13、(4)k152e/l217p/d361g/t382a/d449g/g504s/d524a

14、(5)k152e/t287a/c310y/t382a/g504s/d524a；

15、(6)k152e/t382a/g504s/d524a；

16、(7)k152e/t382a/h504k/g504s/d524a/e562g/q568r；

17、(8)k152e/t382a/g504s/d524a/e607g/d615g；

18、(9)t24a/k152e/t382a/d449s/g504s/d524a；

19、(10)k120e/k152d/t382a/g504s/d524a/h634y；

20、(11)p111l/p127s/d524a/l604n/t605i/s606f；

21、(12)l139p/l452c/s453r/q461k/d524a/s606y；

22、(13)m39v/p100a/d524a/g608s/i611r；

23、(14)e7a/k152e/d524a/g608s/i611r；

24、(15)e176s/m177i/g178c/f199l/d524a；

25、(16)s60r/m66l/k152e/t382a/g504s/d524a；

26、(17)e7g/p141l/k152e/t306a/t382a/e489g/g504s/d524a；

27、(18)k120d/k152d/f309s/t382a/g504s/d524a/t605f；

28、(19)p141l/k152e/d200n/t382a/g504s/d524a/s606l；

29、(20)k152e/t382a/t458a/h459r/g504s/d524a；

30、(21)p111l/k152e/t330p/t382a/g504s/d524a/q568k；

31、(22)k152d/t382a/h459k/q461r/n479d/g504s/d524a；

32、(23)k152e/l362p/t382a/h438k/g504s/d524a；

33、(24)k152e/t382a/h438r/l491p/g504s/d524a；

34、(25)s56a/k152e/p297s/t382a/g504s/d524a；

35、(26)k152d/t382a/h459r/g504s/d524a/r657c/i661t；

36、(27)k152e/t382a/a502v/h503k/g504s/d524a/a536t；

37、(28)k152e/t382a/h503r/g504s/d524a/l603w；

38、(29)k152d/t382a/w388r/g504s/d524a；

39、(30)k152e/a259t/t382a/g504s/d524a/h594k；

40、(31)k152d/d200h/d524a/g608s/i611r/l671p；

41、(32)k152e/d224g/t382a/q461r/g504s/d524a；

42、或所述突变型mmlv逆转录酶具有与组合位点突变(1)-(32)的氨基酸序列一致性90％以上的氨基酸序列，且具有与对应组合位点突变的逆转录酶基本相同的dddp活性。

43、优选的，上述突变型mmlv逆转录酶还具有与对应组合位点突变的逆转录酶基本相同的rddp活性。

44、优选的，上述突变型mmlv逆转录酶还具有与对应组合位点突变的逆转录酶基本相同的rnase h活性。从而使得酶的性能与对应组合位点的酶基本相同。

45、上述的突变型mmlv逆转录酶的编码基因。

46、上述的突变型mmlv逆转录酶的表达载体。

47、优选的，所述表达载体为pet21b(+)。

48、上述的突变型mmlv逆转录酶的重组细胞。

49、优选的，所述重组细胞所用的宿主菌为大肠杆菌rosetta。

50、上述的突变型mmlv逆转录酶在逆转录反应中的应用。

51、逆转录反应的应用场景通常包括转录组测序建库、rt-pcr、rt-qpcr或rt-lamp。

52、一种逆转录试剂盒，其包含上述的突变型mmlv逆转录酶。

53、上述的突变型mmlv逆转录酶在转录组测序建库中的应用。优选地，所述转录组测序包括转录组特异性测序、单细胞转录组测序。

54、一种建库试剂盒，其包含上述的突变型mmlv逆转录酶。本发明提供的建库试剂盒从选用降低甚至完全缺失dddp的mmlv逆转录酶出发，实现了在逆转录过程中，只能从模板rna合成一链cdna，很难以dna为模板合成互补dna链。因此在转录组链特异性建库中，逆转录反应产物中几乎没有二链cdna，极好的保留了rna的方向性，解决了链特异性测序的技术难点。

55、本发明具有如下有益效果：

56、(1)本发明通过氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著降低甚至完全缺失鼠白血病病毒逆转录酶突变体的依赖dna的dna聚合酶活力，不需要额外添加组分来抑制逆转录过程中二链cdna的合成，正常的逆转录体系即可获得纯度极高的一链cdna产物，从而在转录组测序建库中，比如链特异性测序和单细胞转录组测序等中具有极高的链特异性。

57、(2)本发明的突变型逆转录酶具有极低的依赖dna的dna聚合酶活性，同时具有以下一个或者多个特性的提高：热稳定性、灵敏度、在rt-qpcr或rt-lamp中与其他聚合酶的兼容性等。

58、(3)本发明的突变型逆转录酶具有与野生型mmlv逆转录酶基本相当甚至更高的rddp活性，可用于替代野生型mmlv逆转录酶进行常规的逆转录反应。