一种腈水合酶的固载与微环境调控方法及用于己二腈的转化

本发明涉及一种用含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物与二乙烯基砜(dvs)在琼脂糖微球上固载腈水合酶的方法，并可以调控腈水合酶的催化选择性。

背景技术：

0、技术背景

1、纯化自rhodococcuserythropolis ccm2595的腈水合酶(nhase)具有十分优异的生物催化活性，对于二腈类化合物具有很好的选择性，在精细化学品的合成与污水处理方面有重要应用。例如：催化己二腈生成5-氰基戊酰胺，是合成农药的重要中间体。然而，游离的腈水合酶稳定性差、无法循环使用是限制其工业上应用的关键。酶共价偶联固定化提供了更高的稳定性，可重用性，具有易于操作，节能和连续流动生产的优势。然而，nhase由于稳定性差，往往在固定过程中不恰当的偶联位点造成酶的构象变化，保留活性严重下降。且偶联在载体表面的酶，缺乏对于分子取向的控制，存在传质困难、催化位点被遮蔽的问题。基于乙烯基砜与组氨酸标签的特异性反应，在与酶固定的过程中，对酶的取向进行控制，在表面实现定点生物偶联。相较于酶在载体表面发生的多点偶联，定点偶联可以很好的控制酶的分子取向，具有一定的普适性，是固载酶发展的重要方向。

2、微环境的调控是影响固载酶催化性能(相对活性、选择性、稳定性)的关键因素，通过改变载体-酶、酶-底物/产物的分子间相互作用对微环境进行合理设计。对于固定化nhase来说，疏水底物与酶的有效接触差，局部浓度低是导致酶活降低的重要因素。现有的基于乙烯基砜的固载酶平台，由于缺乏合普适的疏水微环境调控方法，导致固载酶的效果不尽如人意。且无法在分子水平上调控疏水微环境的种类与密度。在有机碱催化下，多种乙烯基砜衍生物可以对羟基功能化的载体进行活化是实现调控载体疏水微环境的理论基础。因此，基于nhase通过提高固载酶微环境的疏水性，可以增加酶与载体的相互作用，增加固载酶的稳定性，且促进酶对疏水底物的催化速率。

3、现有的固载酶平台很难同时实现定点偶联与微环境的调控，因此活性和稳定性很难平衡。在nhase的催化体系中，根据文献报道，底物的离去是影响催化速率与选择性的关键，为了减少催化过程中的主产物被载体吸附而进一步发生副反应，在取向可控的前提下，改变疏水微环境调控体系中底物/产物的传质。实现nhase的定点偶联且改变酶分子附近的疏水微环境对促进nhase工业化进程有重要意义，并为新的固载酶体系提供思路。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种腈水合酶的固载与微环境调控方法及用于己二腈的转化，是一种基于腈水合酶(nhase)的微环境可调控的新型固载酶方法，通过改变载体的活化试剂，实现了对于固定化nhase催化性能(相对活性、选择性、稳定性)的调控，被认为是一种绿色可控、潜力巨大的固载酶方法。

2、一种腈水合酶(nhase)的固载与微环境调控方法，所述的方法包括如下步骤：

3、第一步：在有机碱的催化下，将载体与二乙烯基砜(dvs)、含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物在0～37℃、乙腈、乙醇作为溶剂的条件下反应6～12h，由此对载体表面的羟基进行活化，得到含有vs基团修饰的载体。

4、第二步：将步骤(1)得到的vs基团修饰的载体和nhase在pb缓冲溶液中，在0℃～20℃下反应2-12h，对活化后的载体在低温下进行孵育，由此实现对nhase在琼脂糖微球上的定点共价偶联，得到固载腈水合酶。

5、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的载体可以是琼脂糖微球(6ff)，含有辛基的琼脂糖微球(4ff)，含有羧基的琼脂糖微球(cmbff)等。

6、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的载体的粒径为60-150μm，优选为90μm左右。

7、对于上文所述的技术方案中，所述的含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物，包括苯基乙烯基砜(pvs)、甲基乙烯基砜(mvs)、乙基乙烯基砜(evs)及3个碳到7个碳的烷基乙烯砜基中的一种或几种。

8、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的载体与乙烯基砜(dvs)、含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物总计的比例为100mg：0.1～0.5mmol，即按照每100mg载体添加乙烯基砜(dvs)与含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物，乙烯基砜(dvs)与含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物总计为0.1～0.5mmol；含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物与二乙烯基砜(dvs)的摩尔比为1:100～100:1，优选为1:10～10:1。

9、对于上文所述的技术方案中，所述的有机碱为三苯基膦、咪唑或1-甲基咪唑。

10、对于上文所述的技术方案中，所述的载体与有机碱的质量比为100：1～8，例如每100mg载体加入1～8ml有机碱。

11、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的载体与乙腈或乙醇的比例为100mg：1～10ml，按照每100mg载体加入1～10ml乙腈或乙醇。

12、对于上文所述的技术方案中，第一步具体为：将二乙烯基砜(dvs)、含有单乙烯砜基(vs)和憎水基团的化合物混合后，加入载体，在有机碱的催化、0～37℃、乙腈、乙醇作为溶剂的条件下反应6～12h，由此对载体表面的羟基进行活化，得到含有vs基团修饰的载体。

13、对于上文所述的技术方案中，将第一步得到的含有vs基团修饰的载体载体先用乙腈清洗，再用pb缓冲溶液清洗，之后进行第二步骤操作。对于上文所述的技术方案中，所述的第二步pb缓冲溶液的ph为6.5～9.0，优选为7.0～8.0更优选为7.4。

14、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第二步中载体与nhase的质量比为100：0.5～5，优选为100：1～2，例如每100mg载体加入0.5～5mg nhase，优选为每100mg载体加入1～2mg nhase。

15、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第二步中载体与pb缓冲溶液的比例为100mg：1～5ml，即每100mg载体加入1～5ml pb缓冲溶液。

16、第二步：向步骤(1)得到的vs基团修饰的载体和nhase中，加入pb缓冲溶液，在0℃～20℃下反应2-12h，对活化后的载体在低温下进行孵育，由此实现对nhase在琼脂糖微球上的定点共价偶联。

17、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第一步反应的时间为10～12h；第二步反应的时间为9～12h。

18、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第一步反应的温度为25～37℃；第二步反应的温度为0～5℃。

19、本发明还涉及保护上述方法制备的固载腈水合酶。

20、本发明还涉及保护上述固载腈水合酶作为催化剂用于催化己二腈的转化，具体步骤为：将固载腈水合酶与己二腈混合，在pb缓冲液中光照下反应。

21、对于上文所述的技术方案中，固载腈水合酶与己二腈的比例为1mg/100mg载体：10-200mm，1mg/100mg载体：优选为40mm，即按照每1mg/100mg载体的固载酶，添加10-200mm的己二腈，优选为按照每1mg/100mg载体的固载酶，添加40mm的己二腈。

22、对于上文所述的技术方案中，固载腈水合酶与pb缓冲液的比例为1mg/100mg载体：1ml，即按照每1mg/100mg载体的固载酶，添加1ml的pb缓冲液。

23、对于上文所述的技术方案中，反应体系中pb缓冲液的ph为6.5～9.0，优选7.0～8.0，更优选为7.4。

24、对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，己二腈的转化中的反应温度为4～55℃，反应时间为5～20min。

25、有益效果：

26、本发明所述的调控腈水合酶选择性的方法，相对于其他方法有以下优势：

27、(1)固载酶活性高，腈水合酶本就是一种不稳定的蛋白质，一般固定方法并不能保持较高的活性；

28、(2)该方法是对腈水合酶的定点偶联，避免因对酶修饰位置不固定，如修饰在活性基团上而造成失活。

29、(3)反应条件温和，没有高温、低温、强酸、强碱等环境，对腈水合酶友好；

30、(4)操作简单，产物比例可调控；

31、(5)热稳定性好，在相对恶劣的温度仍有较好的活性。

32、综上所述，该方法是一种操作简单，产物可控，环境友好的固载腈水合酶方法。