检测眼内抗VEGF治疗药物抵抗的试剂盒

本发明属于生物检测领域，涉及一种检测眼内抗vegf治疗药物抵抗的试剂盒，具体涉及三个mirna标志物hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p在制备用于检测眼内抗vegf治疗药物抵抗的试剂中的应用。

背景技术：

1、眼底新生血管包括视网膜新生血管(retinal neovascularization,rnv)及脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，cnv)，是很多致盲性疾病导致视力丧失的主要原因，是一系列缺血缺氧性视网膜病变的共同病理特征。rnv多见于增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,pdr)、早产儿视网膜病变(retinopathyofprematurity,rop)等，cnv多见于年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration,amd)，目前临床的治疗主要以血管内皮生长因子-a(vascular endothelialgrowth factor-a，vegf-a)为靶点，然而，由于新生血管致病机制复杂，有很多因素的参与，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)、血管生成素、notch信号通路、wnt信号通路等，单一靶点治疗仅使有限的患者受益。通过抗vegf药物治疗来消退这些新生血管，目前常用的抗vegf药物主要有康柏西普、阿柏西普、雷珠单抗。

2、最新研究显示，抗vegf药物治疗无论是一年期治疗结果还是长期疗效，都不理想。眼内注射抗vegf制剂的有效率在21～34％，约一半以上的患者在治疗过程中出现不同程度的抗vegf药物治疗抵抗现象。显然除了抑制vegf之外，还有其它的促血管生成因子也参与了眼底新生血管的生成。

3、微小非编码rna(microrna,mirna)在来越来越多的研究中被发现可以调节血管新生的各个阶段，mirna功能失调在多种血管新生性疾病的发生发展中发挥重要作用，受到了广泛的关注。mirna是广泛存在于真核细胞中的一种内源性单链非编码rna,长度为21-24个核苷酸，其主要对转录后的基因表达起到调控作用。发明人通过前期研究，发现mirna不仅可通过直接或间接方式作用于vegf及其信号通路从而影响血管新生，也可以通过作用于血管新生相关的其他血管生成因子比如cxc趋化因子受体7(cxcr7)、内皮细胞特异性分子-1(endocan)、ccaat增强子结合蛋白β(cebpb)等，来达到促进或抑制血管新生的作用。

技术实现思路

1、基于临床实践，发明人认为，对于临床上出现眼内抗vegf治疗药物抵抗的患者，可考虑进行多靶点的检测，目前还没有针对于眼内抗vegf治疗药物抵抗的相关检测手段，明确药物抵抗的原因，才能找到优化的治疗方案。发明人在前期大量临床研究的基础上，获得了视网膜、脉络膜新生血管相关房水mirnas表达数据库和特异性标志物，从众多的标志物中遴选出三个成员hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p，作为判断临床出现眼内抗vegf治疗药物抵抗的靶蛋白的检测对象。基于该研究，本发明包括如下技术方案：

2、本发明的一个方面提供了三种mirna标志物hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p在制备用于检测眼内抗vegf治疗药物抵抗的试剂中的应用。

3、hsa-mir-539-5p的核苷酸序列为ugugugguuccuauuaaagagg，其对应的基因dna的核苷酸序列为：tgtgtggttcctattaaagagg(seq id no:6)；

4、hsa-mir-181a-5p的核苷酸序列为ugaguggcugucgcaacuuacaa，其对应的基因dna的核苷酸序列为：tgagtggctgtcgcaacttacaa(seq id no:7)；

5、hsa-mir-376b-3p的核苷酸序列为ugcaccuaaaaggagauacua，其对应的基因dna的核苷酸序列为：tgcacctaaaaggagatacta(seq id no:8)。

6、该应用的实施方式中，利用这三种mirna标志物在人体中的表达量来诊断是否存在眼内抗vegf治疗药物抵抗。

7、优选地，上述标志物hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p的表达量是指房水中的表达量。表达量检测指标为△ct值＝ct(目的基因)-ct(u6)。

8、在检测眼内抗vegf治疗药物抵抗时，如果3个标志物中有2个或3个出现表达量(或称表达水平)异常降低情况，或者其中1个出现表达量(或称表达水平)特别低情况，则判定为有相应靶蛋白过表达，提示临床上出现眼内抗vegf治疗药物抵抗的靶蛋白，建议临床结合oct和octa表现，评估抗vegf治疗疗效及预后。

9、上述用语“异常降低”是指低于正常受试者(眼内抗vegf疗效佳的受试者)平均水平(简称正常水平)2倍以上；所述“特别低”是指低于正常受试者平均水平(简称正常水平)5倍以上。

10、目前临床统计的正常受试者平均△ct表达值中，房水中mir-539-5p平均表达值为1.82，房水中mir-181a-5p平均表达值为1.36，房水中mir-376b-3p平均表达值为2.41。

11、作为上述应用的一种实施方式中，本发明的另一个方面提供了用于检测三个mirna标志物hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p的试剂盒。

12、优选上述试剂盒用于检测房水中三个标志物hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p的表达量。

13、上述试剂盒例如包括逆转录和rt-qpcr反应常用的生化试剂等。其中用于逆转录的试剂包括：逆转录buffer(5×)、高效逆转录酶、dntp混合物、stem-loop primer(20×)，depc水，用于rt-qpcr反应的试剂包括sybr green荧光染料混合物(2×)、rox参比染料、depc水、hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p、hsa-mir-376b-3p和内参比如u6的pcr引物等。为了比较被检测个体与正常水平的差异大小，优选试剂盒还包括从眼内抗vegf疗效好的受试者房水中提取的总rna混合样品，将该rna混合样品检测值作为正常表达量参考值。

14、具体地，上述试剂盒至少包括：用于从房水样本中提取分离总rna的rna提取分离系统；用于将总rna逆转录成cdna的逆转录系统；用于检测hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p和内参基因的引物。

15、上述内参基因选自u6、actb、gapdh或者18srna，更优选u6。

16、优选地，上述引物用于通过荧光实时定量pcr将mirna和内参基因u6进行扩增，包括：

17、mir-181a-5p正向引物：5′-cgaacattcaacgctgtcg-3′(seq id no:1)，

18、mir-376b-3p正向引物：5′-gccgagatcatagaggaaaatc-3′(seq id no:2)，mir-539-5p正向引物：5′-ggagaaattatccttggtgtgt-3′(seq id no:3)，

19、内参u6正向引物：5′-cgcgagagaagattagcatgg-3′(seq id no:4)，

20、通用反向引物：5′-agtgcagggtccgaggtatt-3′(seq id no:5)。

21、设计的该通用反向引物为试剂盒的pcr系统的形成提供了便利，避免了多种反向引物容易搞混导致的检测失败，也提高了检测效率。

22、在一种具体的实施方式中，上述试剂盒还可以包括记载用于确定临床上出现眼内抗vegf治疗药物抵抗的靶蛋白的数学模型的载体，所述数学模型是：

23、目的基因相对表达量＝2-△△ct，△ct＝ct(目的基因)-ct(u6)，△△ct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)，其中目的基因包括hsa-mir-539-5p、hsa-mir-181a-5p及hsa-mir-376b-3p，“实验组”为检测对象，“对照组”为正常受试者(眼内抗vegf疗效佳的受试者)。

24、上述数学模型的依据是荧光定量pcr分析中的常用公式△△ct(n)＝△ct(n)-△ct(1)，公式中n是指待检测样本，1特指代对照样本，△△ct(n)＝△ct(n)-△ct(对照)，而且最后的公式是表达量＝2^(-△△ct)。该公式有现成的计算软件，科研人员简单地将实验数据输入电脑或者pcr仪即可得到计算结果。

25、在一种实施方式中，上述载体是说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如cd、u盘、网盘等。

26、上述试剂盒中，用于逆转录的试剂例如包括2×mirnal-rt solution mix，mirnal-rt enzyme mix，stem-loop primer(10μm)，rnase-free water。用于rt-qpcr反应的试剂例如包括2×sybr green mix。

27、优选地，上述试剂盒中还包括从正常受试者(眼内抗vegf疗效佳的受试者)房水中提取的总rna混合样品，其pcr检测值作为正常表达量参考值。

28、本发明的试剂盒灵敏度高，特异性强且定量精确的诊断试剂盒，可用于临床眼内抗vegf治疗效果不佳的进一步检测，有助于判断眼内抗vegf治疗药物抵抗的因素，为临床医生快速准确判断病情提供及时且个性化的治疗方案，实现针对患者的精准医疗。