一种AsperparalineA的生物合成及提纯的方法与流程

【】本发明属于微生物源杀虫剂的应用领域，涉及一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，也是一种利用棘孢曲霉ys-1生物合成asperparaline a并进行高效提取的方法。

背景技术

0、
背景技术：

1、asperparaline a是一种含[2,2,2]－环二氮辛烷环系统的异戊烯基吲哚生物碱，它作为aspergillus japonicus jv-23产生的代谢产物被首次报道，对哺乳类的消化道寄生线虫的3龄幼虫具有驱虫活性。有研究进一步发现该物质对褐飞虱等农业害虫表现出杀虫活性(专利国际公开第2010/071218号)。此外，也有研究报道了该物质对硬蜱、蚤等动物寄生性害虫显示杀虫活性，而且对哺乳动物具有安全性(专利国际公开第2010/071219号)。综上所述，asperparaline a具有作为杀虫剂的潜力，可开发为一种新的微生物源农药。

2、关于asperparaline a的制备工艺，目前报道的方法是将jv-23菌株发酵过的原料(9公斤)浸泡在甲醇中，蒸发甲醇得到的水浓缩物用二氯甲烷提取，得到的二氯甲烷萃取物在正己烷和90％甲醇之间进行分配，然后将下层浓缩并用乙酸乙酯提取；乙酸乙酯层随后在无水硫酸钠上干燥、过滤并蒸发至干性；残余物(3.98克)在wakogel c-200上进行色谱分析，用乙酸乙酯和增加甲醇比例的溶液洗脱，得到25％甲醇洗脱物(600mg)；25％甲醇洗脱液在wakogel c-200上用氯仿-甲醇混合物进一步层析，对5％的甲醇洗脱液进行重结晶，得到asperparaline a(1204mg)。

3、上述利用aspergillus japonicus jv-23提取分离纯化asperparaline a的过程较为复杂，该研究采用硅胶色谱柱进行柱层析分离，所用的固定相和流动相成本较高，难以进行实际的工业生产。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、针对现有研究中尚未见到asperparaline a人工全合成或半合成的报道的情况，本发明提供了一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，是一种从棘孢曲霉aspergillus aculeatus ys-1中快速高效提取asperparaline a的生物合成方法，该方法包括ys-1的培养收集，代谢产物的提取、分离纯化、结构鉴定等步骤，通过生物合成提纯asperparaline a具有效率高、成本低、绿色环保、便于操作、易于放大等优点。

2、发明人在桂林市阳朔县田间调查时发现僵死的柑桔木虱成虫，从虫尸上分离得到多株真菌，其中一株鉴定为棘孢曲霉aspergillus aculeatus，命名为aspergillusaculeatusys-1，并于2020年7月7日保存在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.61081。

3、本发明技术方案如下：

4、一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，包括以下步骤：

5、s1.发酵培养：发酵培养棘孢曲霉aspergillus aculeatus ys-1菌株，获得真菌孢子；

6、s2.提取有效成分：通过醇溶液提取aspergillus aculeatus ys-1孢子，并浓缩得到浸膏；

7、s3.柱层析纯化分离：将浸膏用水分散溶解，进行柱层析梯度洗脱，收集、合并特定的洗脱液并浓缩，得到浓缩洗脱液；

8、s4.精制：将浓缩后的洗脱液静置，重结晶，过滤母液，所得晶体即为asperparaline a。

9、s1步骤中，棘孢曲霉aspergillus aculeatus ys-1菌株，是从桂林市阳朔县田间僵死的柑桔木虱成虫的虫尸上分离得到的真菌，其中一株鉴定为棘孢曲霉aspergillusaculeatus，命名为aspergillus aculeatus ys-1，并于2020年7月7日保存在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmccno.61081。

10、s1步骤中，选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)或其他固态培养基进行室内发酵培养，培养时间为3-15天，培养温度20-38℃。

11、s2步骤中，采用体积分数为30-95％的甲醇或乙醇溶液，固液比(g:ml)为1:10-1:40。

12、s2步骤中，提取方式采用超声波辅助提取、微波辅助提取、加热回流提取、双水相萃取。

13、s2步骤中，若采用超声波辅助提取，优选条件如下：取100-300g的ys-1孢子原料于锥形瓶中，向其中加入1000-6000ml体积分数为30-95％甲醇溶液，在30-80℃条件下超声提取30-90min，功率200-800w，频率20-80khz，重复提取2-5次，然后再通过负压蒸馏除去溶剂得到浸膏。

14、s3步骤中，称量浸膏的质量(g)，加5-20倍体积(ml)纯净水溶解分散溶解，等待湿法上柱。

15、s3步骤中，大孔树脂选自d101、ab-8、lx-8或lsa-7等其他大孔树脂。

16、s3步骤中，若采用d101大孔树脂为固定相，优选洗脱条件为：依次用体积分数为15％、25％、30％、40％的乙醇溶液进行洗脱，每个梯度洗脱体积为1.0-10.0bv，控制流速为0.5-5.0bv/h，收集30％、40％乙醇的洗脱液并浓缩合并。

17、s4步骤中，精制的方法包括结晶、沉淀、膜分离、制备液相色谱、硅胶柱层析或ods柱层析。

18、s4步骤中，静置浓缩后洗脱液，等待自然析出结晶，过滤掉母液之后获得目标有效成分asperparaline a。

19、更具体的，

20、本发明所述的一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，是一种利用aspergillus aculeatus ys-1生物合成和提纯asperparaline a的方法，包括以下步骤：

21、s1：棘孢曲霉ys-1的获得：

22、在桂林市阳朔县田间发现僵死的柑桔木虱成虫，从虫尸上分离得到多株真菌，其中一株鉴定为棘孢曲霉aspergillus aculeatus，命名为aspergillus aculeatus ys-1；

23、s2：棘孢曲霉ys-1的培养及孢子收集：

24、将柑橘木虱僵虫身上的棘孢曲霉ys-1(aspergillus aculeatus ys-1)孢子分别接种到2000个pda培养基上，在室内连续培养7天后，将棘孢曲霉ys-1孢子震落到锥形瓶中，获得有强侵染力的孢子；

25、s3：棘孢曲霉ys-1次生代谢物的提取：

26、称取150g上步骤得到的ys-1孢子原料加入4l体积分数为85％甲醇，分4份于三角瓶中，在50℃条件下超声提取60min，重复提取三次，然后再通过负压蒸馏除去溶剂，合并后得浸膏50.0g，加500ml纯净水溶解分散，制得浓缩液；

27、s4：asperparaline a的纯化提取：

28、s4-1：大孔树脂预处理：

29、准备新购大孔树脂5.0l，向其中加入95％乙醇，静置24h，随后加入到空层析柱中，待其自然沉降后用乙醇以2.0bv/h的流速通过树脂层，洗至流出液无白色浑浊，之后用蒸馏水将乙醇替换，冲洗至流出液无醇味为止；接下来用2.0bv 5％(v/v)hcl溶液，以4.0-6.0bv/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，而后用水以同样流速洗至出水ph中性,再用2.0bv的2.0％(w/v)naoh溶液，以4.0-6.0bv/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，而后用水以同样流速洗至ph中性；

30、s4-2：大孔树脂的选择和洗脱条件的优化：

31、分别取预处理过的d101、ab-8、lx-8、lsa-7型大孔树脂柱层析分离棘孢曲霉ys-1的85％(v/v)甲醇溶液提取物(浓缩液)，湿法装柱，并依次以纯水、体积分数为20％、40％、60％、80％、95％的乙醇溶液作为流动相进行分离洗脱，根据洗脱液的生物活性强弱筛选大孔树脂；根据hplc的分析结果合并色谱图相似的大孔树脂洗脱液，并进一步优化洗脱液的乙醇比例；

32、s4-3：分离纯化：

33、将s3所得浓缩液用玻璃棒缓缓引流至大孔树脂层析柱中，加样完成后，静置30min使样品充分吸附在大孔树脂上；依次用体积分数为15％、25％、30％、40％的乙醇溶液进行梯度洗脱，最后用95％的乙醇溶液冲洗层析柱，每个梯度洗脱体积为1.0bv，控制流速为2.0bv/h。将30％、40％乙醇溶液的洗脱液采用等流份法(1l)进行收集，并通过旋转蒸发仪减压浓缩，将浓缩液合并于4℃下静置过夜，等待其自动析出晶体。用95％乙醇溶液冲洗过的层析柱，可重复使用。

34、s5：asperparaline a提纯物的纯度检测和结构鉴定：

35、s5-1：asperparaline a的hplc纯度检测：

36、仪器型号：岛津lc-20a；

37、色谱柱：inertsil ods-3(4.6mm i.d.×250mm，5μm)；

38、流动相：水(a相)，甲醇(b相)；

39、梯度程序：0-25min，b％：5-100％；

40、流速：1ml·min-1；

41、柱温：35℃；

42、进样量：5.0μl；

43、波长：206nm。

44、s5-2：asperparaline a结构鉴定：

45、对提取纯化的asperparaline a进行了x射线单晶衍射、核磁共振(nmr)和高分辨质谱(hr-ms)分析，并与文献、pubchem数据库进行比较匹配，以明确asperparaline a的结构。

46、本发明中：

47、步骤s4-2所述的大孔树脂的选择和洗脱条件的优化，优选d101大孔树脂，试验发现，d101大孔树脂对粗提物的选择性较好，40％(v/v)乙醇洗脱液生物活性明显高于其他大孔树脂的各比例洗脱液(见图1)，能够有效富集棘孢曲霉ys-1的活性成分，根据hplc的分析结果合并色谱图相似的d101洗脱液，并进一步优化洗脱液的乙醇比例。

48、和现有技术相比，本发明具有如下优点：

49、1、本发明所述的一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，效率高，每150g真菌孢子可提取出121mg目标化合物，且提取后经过简单柱层析并浓缩可自然析出高纯度的晶体，省去了萃取等繁杂步骤。

50、2、本发明所述的一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，成本低，提取纯化所用到的溶剂主要为水、乙醇、甲醇，以及大孔树脂，均为常见大宗化工产品，成本低廉。

51、3、本发明所述的一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，无污染，提取有效成分所用的溶剂均可蒸馏后可再次利用，层析柱的固定相和流动相也可以在处理之后反复利用，整个过程绿色环保。

52、4、本发明所述的一种asperparaline a的生物合成及提纯的方法，适用于微生物发酵工艺，实际生产中，采用大孔树脂处理微生物次生代谢物时，可以在液态发酵阶段将树脂加入到发酵液中，大孔树脂会吸附目标产物，促进生物合成反应向产生目标产物的方向进行，该方法可以有效减少发酵过程中的反馈抑制现象，大大提高活性物质的产量。