一株高效生产赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建

本发明涉及一种重组解脂耶氏酵母菌及其在生产赤藓糖醇中的应用，属于生物工程。

背景技术：

1、赤藓糖醇(1,2,3,4-丁四醇)是一种具有甜味和低热量的功能性糖醇，一般由微生物发酵生产。以前的研究主要集中在利用耐渗酵母菌株生产赤藓糖醇。例如，利用ntg处理和紫外突变来提高菌株aureobasidium sp.sn-124a的赤藓糖醇生产率，获得了最大赤藓糖醇滴度为170g/l(具体可见参考文献：ishizuka,h.,wako,k.,kasumi,t.,sasaki,t.,1989.breeding of a mutant of aureobasidium sp.with high erythritolproduction.j.ferment.bioeng.68(5),310-314.)。对于菌株moniliella sp.，各种策略已被成功地应用于促进赤藓糖醇的生产，最高可达152g/l(具体可见参考文献：lin,s.j.,wen,c.y.,wang,p.m.,huang,j.c.,wei,c.l.,chang,j.w.,chu,w.s.,2010.high-levelproduction of erythritol by mutants of osmophilic moniliellasp.process.biochem.45(6),973-979.)。然而，尽管这些工艺中的一些已经发展到工业规模，但上述菌株在工业化应用中仍存在发酵培养基的高成本，以及副产物多使下游加工变得复杂的困扰。

2、yarrowia lipolytica是一种非常规的酵母，其对高盐、极端ph和各种有机化合物有很强的耐受性，这简化了生物过程的优化。此外，y.lipolytica有清晰的遗传背景和成熟的遗传操作工具，可以进行合理的工程设计。出于这些原因，已经进行了一系列的工作来提高y.lipolytica的赤藓糖醇生产力，这些研究大多基于ura blast和cre/lox位点特异性重组系统对y.lipolytica进行靶向、重复和无标记的基因整合。然而，上述方法有一些缺点，如效率低、耗时长等，这严重阻碍了对提升y.lipolytica生产赤藓糖醇的进一步研究。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足，目的在于提高现有技术当中的赤藓糖醇的生产菌株的滴度及产量，本发明提供了一种高产赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其应用。

2、本发明提供的第一个技术方案为一种重组解脂耶氏酵母菌，以解脂耶氏酵母菌为出发菌，敲除ku70基因和eyd基因，并过表达了磷酸戊糖途径关键靶基因，所述磷酸戊糖途径关键靶基因包括来源于解脂耶氏酵母菌的基因转酮酶基因tkl、转醛酶基因tal、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf、6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶基因gnd、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶基因rpe、核糖5-磷酸异构酶基因rpi、赤藓糖还原酶基因er10、赤藓糖还原酶基因er27、果糖1，6-二磷酸酶基因fbp、磷酸丙糖异构酶基因tpi和来源于木兰念珠菌的赤藓糖还原酶基因alr中的一个或多个。

3、在某些实施方式中，所述磷酸戊糖途径关键靶基因包括来源于解脂耶氏酵母菌的tkl基因和tal基因。

4、进一步，所述tkl基因和tal基因的拷贝数为1～3。

5、在某些实施方式中，所述磷酸戊糖途径关键靶基因包括来源于解脂耶氏酵母菌的tkl基因、tal基因、rpe基因和rpi基因。

6、进一步，所述rpe基因和rpi基因的拷贝数为1～2。

7、在某些实施方式中，所述磷酸戊糖途径关键靶基因包括来源于解脂耶氏酵母菌的tkl基因、tal基因、rpe基因和rpi基因、fbp基因和tpi基因。

8、进一步，所述fbp基因的拷贝数为1～2，所述tpi基因的拷贝数为1～3。

9、在某些实施方式中，所述磷酸戊糖途径关键靶基因包括来源于解脂耶氏酵母菌的tkl基因、tal基因、rpe基因和rpi基因、fbp基因和tpi基因、zwf基因和gnd基因。

10、进一步，所述zwf基因和gnd基因的拷贝数为1～4。

11、在某些实施方式中，所述磷酸戊糖途径关键靶基因包括来源于解脂耶氏酵母菌的tkl基因、tal基因、rpe基因和rpi基因、fbp基因和tpi基因、zwf基因和gnd基因，同时所述磷酸戊糖途径关键靶基因还包括解脂耶氏酵母菌的er10基因和er27基因以及来源于木兰念珠菌的alr基因。

12、在某些实施方式中，所述磷酸戊糖途径关键靶基因由启动子8uas1bxpr2-ptefin、php4d、per10或palr启动。

13、在某些实施方式中，所述重组解脂耶氏酵母同时还敲除了蛋白激酶基因cla4和转录因子mhy1。

14、在某些实施方式中，所述重组解脂耶氏酵母以pcrispryl质粒和phr质粒为表达载体。

15、所述pcrispryl质粒表达载体购自addgene。

16、所述phr质粒在puc19质粒基础上构建获得，具体的构建方法参照“schwartz,c.,shabbir-hussain,m.,frogue,k.,blenner,m.,wheeldon,i.,2017b.standardizedmarkerless gene integration for pathway engineering in yarrowialipolytica.acs.synth.biol.6(3),402-409.”也可购自addgene。

17、在某些实施方式中，所述重组解脂耶氏酵母菌是以yarrowia lipolytica po1f为出发菌株。

18、本发明第一个技术方案中重组解脂耶氏酵母菌，首先，通过敲除菌株yarrowialipolytica po1f的ku70和eyd基因来提高同源重组的效率和调控赤藓糖醇降解途径，得到基础菌株e002。其次，11个关键靶基因和一个强启动子8uas1bxpr2-ptefin被挖掘，证明均可以提高赤藓糖醇的生产水平。在此基础上，对磷酸戊糖途径进行了优化，重点集中在加强关键前体物的合成(tkl基因、tal基因、rpe基因、rpi基因、fbp基因和tpi基因)、辅因子nadph的供应(zwf基因和gnd基因)和核心途径酶(er10基因、er27基因和alr基因)的表达，成功实现了赤藓糖醇的高产。最后，敲除了影响细胞形态的cla4和mhy1基因，成功地将菌丝转回酵母形态，使得重组菌株更利于工业应用。

19、本发明提供的第二技术方案为构建第一技术方案中所述的重组解脂耶氏酵母的方法，所述方法包括以下步骤：

20、(1)以pcrispryl质粒和phr质粒敲除出发菌株解脂耶氏酵母菌基因组上的ku70基因；

21、(2)以pcrispryl质粒和phr质粒敲除步骤(1)改造后的解脂耶氏酵母菌基因组上的edy基因；

22、(3)以pcrispryl质粒和phr质粒在步骤(2)改造后的解脂耶氏酵母菌中过表达磷酸戊糖途径关键靶基因，所述磷酸戊糖途径关键靶基因包括来源于解脂耶氏酵母菌的tkl基因、tal基因、zwf基因、gnd基因、rpe基因、rpi基因、er10基因、er27基因、fbp基因、tpi基因和alr基因中的一个或多个；

23、(4)以pcrispryl质粒和phr质粒敲除步骤(3)改造后的解脂耶氏酵母菌基因组上的cla4和mhy1基因。

24、对于基因的敲除，将质粒phr(携带靶标基因的上下游各1kb同源臂和ura3筛选标记)和crispr-cas9表达质粒pcrispryl(携带相应的sgrna和leu2筛选标记)共转化到y.lipolytica菌株中，定位并敲除靶标基因；

25、对于基因过表达，和基因敲除原理相似，将质粒phr(携带靶标基因上下游两个各1kb同源臂和相应的过表达的基因)和crispr-cas9表达质粒pcrispryl(携带相应的sgrna和leu2筛选标记)共转化到y.lipolytica菌株中，定位并过表达相应的基因。

26、本发明还提供的第三个技术方案为一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法为，采用第一个技术方案中所述的重组解脂耶氏酵母菌为发酵菌株，生产赤藓糖醇。

27、在某些实施方式中，将所述重组解脂耶氏酵母菌种子液添加至含有以葡萄糖为唯一碳源的反应体系中进行发酵，制备得到发酵液，从发酵液中分离得到赤藓糖醇。

28、进一步，将所述重组解脂耶氏酵母菌接种至种子培养基中进行培养，得到一级种子液；将一级种子液按照10％的接种量转接至种子培养基中，进行培养，得到二级种子液；将制备得到的二级种子液按照20％的接种量接种至以葡萄糖为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵，制备得到赤藓糖醇。

29、所述发酵培养基为：葡萄糖200g/l，酵母提取物8.0g/l，柠檬酸铵5.0g/l，kh2po40.25g/l，mgso4·7h2o 0.25g/l，nacl 25g/l，mnso4·h2o 0.05g/l，znso4·7h2o 0.05g/l，cuso4·5h2o 0.01g/l，ph 3.0。

30、所述种子培养基为：葡萄糖100g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，ph自然。

31、在某些实施方式中，将重组解脂耶氏酵母接种至种子培养基中，培养条件为：30℃、220rpm，ph自然，培养时间14h。

32、在某些实施方式中，所述方法为采用5l发酵罐发酵制备赤藓糖醇，所述方法为：将重组解脂耶氏酵母接种至种子培养基中进行培养，得到一级种子液；将一级种子液按照10％(v/v)的接种量转接至种子培养基中，进行培养，得到二级种子液，将制备得到的二级种子液按照20％(v/v)的接种量接种至以葡萄糖为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵，制备得到赤藓糖醇。

33、在某些实施方式中，将种子液接种至发酵培养基中，所述发酵条件为：30℃、800rpm，溶氧20～30％，ph 3.0，培养时间144h。

34、在某些实施方式中，发酵培养基为：葡萄糖200g/l，酵母提取物8.0g/l，柠檬酸铵5.0g/l，kh2po40.25g/l，mgso4·7h2o 0.25g/l，nacl 25g/l，mnso4·h2o 0.05g/l，znso4·7h2o 0.05g/l，cuso4·5h2o 0.01g/l，ph 3.0。

35、在某些实施方式中，种子培养基为：葡萄糖100g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，ph自然。

36、在某些实施方式中，5l发酵罐发酵过程中搅拌速度设置为800rpm，温度设置为30℃，溶氧控制在20～30％，利用3m naoh将ph控制在3.0，发酵时长为144h。

37、本发明还提供的第四个技术方案为第一个技术方案所述的重组解脂耶氏酵母或者第三个技术方案所述的方法在制备含有赤藓糖醇的产品中的应用。

38、有益效果

39、(1)本发明以葡萄糖作为赤藓糖醇生产的底物，提供了一株可高效生产赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母，将此重组解脂耶氏酵母接种至5l发酵罐中发酵144h，赤藓糖醇的滴度高达249.4g/l，转化率高达57％，这是到目前为止报道的通过系统代谢改造y.lipolytica菌株从葡萄糖中获得的最高赤藓糖醇滴度。本发明为高水平赤藓糖醇的工业化生产提供了一株优秀的菌株，并为其他功能性糖的进一步开发提供了一个可行的策略。

40、(2)本发明敲除了ku70基因将同源重组的效率提高至86％，敲除了eyd基因，调控赤藓糖醇降解途径，避免赤藓糖醇的降解，最终赤藓糖醇滴度、产量和产率分别提高27.5％、32.5％和29.1％。

41、(3)本发明中挖掘并验证了11个(zwf,gnd,rpe,rpi,tkl,tal,er10,er27,fbp,tpi,和alr)有助于赤藓糖醇生物合成的靶标基因，通过利用8uas1bxpr2-ptefi启动子过表达上述11个基因，使基础菌株e002的赤藓糖醇的发酵产量提升4-8倍。

42、(4)本发明通过敲除cla4基因和mhy1基因，有效抑制菌丝的形成，从而提高赤藓糖醇的产量。

43、(5)本发明以yarrowia lipolytica po1f为出发菌株，具有遗传背景清晰，易于基因工程操作，安全性好，来源广泛的优势。

44、(6)本发明使用crispr/cas系统对解脂耶氏酵母进行改造，解决了传统技术的效率低、耗时长等问题，取得了在提高赤藓糖醇产量的同时节省了筛选标记的回收时间，实现高赤藓糖醇菌株的快速构建效果。