用于治疗帕金森病的基因治疗载体及其用途的制作方法

本技术涉及基因治疗领域，具体涉及用于治疗帕金森病的基因治疗载体和组合物。

背景技术：

1、帕金森病(parkinson's disease，pd)是一种常见的神经退行性疾病。pd患者以黑质区多巴胺能神经元丢失为特征。多巴胺能神经元主要是一类能产生多巴胺的神经元，能将神经冲动信号传递至纹状体，而纹状体主要控制骨骼肌的运动，因此多巴胺合成的减少导致了机体的运动障碍。患者的主要临床表现为：运动迟缓、肌强直、静止性震颤、姿势步态异常等。pd影响全球约1％的55岁以上的人群，随着社会步入老年化，患者群体还会持续扩大。

2、帕金森病的常见治疗方法是口服给药多巴胺的前体—左旋多巴，该药物在治疗早期病情缓解效果较好，但是随着治疗“蜜月期”的结束，左旋多巴会导致多种运动并发症。而多巴胺激动剂类药物虽能一定程度缓解症状，但长期使用会导致消化道反应和精神症状等不良反应。手术治疗虽能改善症状，但不能根治疾病，术后仍需应用药物治疗，也可能带来相关并发症，如舌头和手的麻痹、辨距不清和意识不清等症状，也存在一定局限性。

3、基因治疗对于帕金森病治疗具有独特优势，一方面是将相关基因通过载体导入病灶部位，对靶点区域的细胞进行修复、补偿和校正，以恢复相关区域正常生理功能。主要是通过导入神经营养因子(包括胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、neurturin和脑源性神经营养因子(bdnf))促进和保护相关神经元的存活。但是，多数pd患者发病时大量的多巴胺神经元丢失，因此，通过提升患者相关神经核团对多巴胺的合成可能是治疗该疾病的关键。多巴胺的合成主要由以下几个酶参与：酪氨酸羟化酶(th)、芳香族氨基酸脱羧酶(aadc)和gtp-环化水解酶1(gch1)。酪氨酸经过酪氨酸羟化酶(th)催化合成左旋多巴，随后芳香族氨基酸脱羧酶(aadc)将左旋多巴转化为多巴胺。th需要由四氢生物蝶呤作为辅酶，而四氢生物蝶呤由gtp-环化水解酶1(gch1)催化合成。因此，表达th、aadc和gch1可以高效合成多巴胺。

4、目前处于研发阶段的以多巴胺合成酶为靶点的帕金森病基因治疗策略，是采用慢病毒载体携带包含th、gch1和aadc的表达载体导入病灶部位，依靠高效表达的th、gch1及aadc来提高中脑纹状体部位的局部多巴胺有效浓度，用于治疗帕金森病。英国的oxfordbiomedica和美国的axovant gene therapy联合开发的以多巴胺合成酶为靶点的帕金森病基因治疗在研药axo-lenti-pd(oxb-102)就是采用的这种策略。目前该在研药处于临床i/ii期研究阶段，动物及临床试验数据证据证明该药可以有效的提高中脑纹状体的局部多巴胺，并且改善相关帕金森病症状，长期药效学研究尚在调查中。然而，慢病毒包装的三基因载体在体内神经细胞中转导效率低，多巴胺合成效率低，导致临床前模型动物药效和临床药效未获得大幅改善。

5、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)载体隶属于细小病毒科依赖病毒属，是一类微小、无被膜的线性单链dna病毒。因其转染效率高，安全性高，已成为目前基因治疗中应用最广泛的病毒载体之一。由于aav载体的包装载量局限性，只能够包装4.7kb以内的dna片段，目前国际上还未报道由aav包装三个基因来表达多巴胺合成酶以治疗帕金森病的临床试验进展。美国公司voyager therapeutics以aav2-haadc作为载体，将其颅内注射至病人的壳核区域以高效表达aadc，通过提高左旋多巴转化成多巴胺的效率来实现治疗帕金森病的目的。然而，这种治疗策略依旧需要依靠患者摄入多巴胺前体药物来实现，改变不了患者长期对美多芭等多巴胺前体药物的依赖。

6、目前迫切需要一种优化的治疗帕金森病的基因治疗载体。

技术实现思路

0、发明概述

1、针对现有治疗技术的不足，本发明提供了包含编码合成多巴胺的三种关键酶——酪氨酸羟化酶(th)、芳香族氨基酸脱羧酶(aadc)和gtp-环化水解酶1(gch1)的aav载体，其中th、gch1和aadc中的任意一种或多种是野生型或其功能性变体的截短形式，并且编码三种酶的核酸序列以多种排列顺序和连接方式串联。本发明突破了aav载体包装三个目的基因的难点，通过不断的构建体优化，截取目的基因的功能区域，从而减少三个基因串联后片段大小，满足aav载体包装需求。本发明的aav载体在递送至小鼠脑内神经细胞后能够有效提高多巴胺合成效率，并且在帕金森病大鼠模型中达到接近功能性治愈的优异的治疗效果。

2、相应地，在第一方面，本发明提供了aav载体，其包含编码酪氨酸羟化酶(th)、gtp-环化水解酶1(gch1)和芳香族氨基酸多巴脱羧酶(aadc)的核酸序列，其中编码th、gch1和/或aadc的核酸序列通过编码接头的核酸序列符合读码框地连接，其中，所述th、gch1和aadc中的任意一种或多种是野生型或其功能性变体的截短形式且具有多巴胺合成通路中所需的催化活性。

3、在一些实施方案中，本发明的aav载体编码的th是野生型th或其功能性变体的截短形式且具有催化酪氨酸合成左旋多巴的活性。在一些实施方案中，th包含330至390个氨基酸残基。在一些实施方案中，th包含330至380、330至370、330至360、330至350、330至340、335至340、335至380、340至380、350至380、360至380或370至380个氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，th包含330至340个氨基酸残基。在一些更优选的实施方案中，th包含335至340个氨基酸残基，例如，335、336、337、338、339或340个氨基酸残基。

4、在一些实施方案中，th包含与seq id no:11具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，gch1包含与seq id no:9具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，aadc包含与seq id no:7具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

5、在一些实施方案中，连接th、gch1和/或aadc的接头包括融合接头、2a肽类接头和/或内部核糖体进入位点(ires)。

6、在一些实施方案中，融合接头为肽接头。在一些实施方案中，肽接头选自(ggs)n，(gggs)n或(ggggs)n，其中n为1至5的整数。在一些优选的实施方案中，融合接头为(ggggs)3。

7、在一些实施方案中，2a肽类接头包含选自以下的2a肽：口蹄疫病毒2a肽(f2a)、猪捷申病毒2a肽(p2a)、thosea asign病毒2a肽(t2a)和/或马鼻炎病毒2a肽(e2a)。在一些实施方案中，2a肽类接头的n末端和/或c末端还包含gsg氨基酸序列，优选n末端包含gsg氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，2a肽类接头包含与seq id no:13或seq id no:15具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

8、在一些实施方案中，本发明的aav载体中编码th、gch1和aadc的核酸序列从上游至下游以选自以下任一项的顺序排列：

9、(1)th、gch1、aadc；

10、(2)aadc、gch1、th；

11、(3)aadc、th、gch1；

12、(4)gch1、th、aadc；

13、(5)gch1、aadc、th；或

14、(6)th、aadc、gch1。

15、在一些实施方案中，本发明的aav载体中编码th、gch1和aadc的核酸序列从上游至下游以选自以下任一项的方式连接：

16、1)th-f2a-gch1-p2a-aadc；

17、2)gch1-p2a-th-p2a-aadc；

18、3)gch1-p2a-aadc-p2a-th；

19、4)aadc-e2a-gch1-(g4s)3-th；

20、5)gch1-f2a-th-f2a-aadc；

21、6)aadc-(g4s)3-th-t2a-gch1；

22、7)aadc-(g4s)4-th-t2a-gch1；

23、8)aadc-p2a-gch1-p2a-th；

24、9)aadc-t2a-gch1-(g4s)3-th；

25、10)gch1-f2a-th-p2a-aadc；

26、11)gch1-f2a-aadc-f2a-th；

27、12)aadc-(g4s)3-gch1-f2a-th；

28、13)gch1-e2a-th-t2a-aadc；

29、14)gch1-f2a-aadc-p2a-th；

30、15)aadc-(g4s)3-gch1-p2a-th；

31、16)aadc-(g4s)5-gch1-p2a-th；

32、17)th-(g4s)3-gch1-p2a-aadc；

33、18)gch1-t2a-aadc-e2a-th；

34、19)aadc-(g4s)3-gch1-t2a-th；

35、20)gch1-e2a-th-p2a-aadc；

36、21)aadc-(g4s)3-gch1-e2a-th；

37、22)gch1-e2a-aadc-p2a-th；

38、23)aadc-(g4s)3-gch1-(g4s)3-th；

39、24)gch1-t2a-th-e2a-aadc；

40、25)gch1-(g4s)3-th-t2a-aadc；

41、26)gch1-(g4s)2-th-t2a-aadc；

42、27)gch1-p2a-aadc-t2a-th；

43、28)th-p2a-gch1-p2a-aadc；

44、29)th-(g4s)3-gch1-t2a-aadc；

45、30)gch1-(g4s)3-th-e2a-aadc；

46、31)gch1-t2a-th-(g4s)3-aadc；

47、32)th-p2a-gch1-f2a-aadc；

48、33)gch1-f2a-th-(g4s)3-aadc；

49、34)th-f2a-gch1-f2a-aadc；

50、35)th-(g4s)3-gch1-e2a-aadc；

51、36)th-g4s-gch1-e2a-aadc；

52、37)gch1-p2a-th-(g4s)3-aadc；

53、38)aadc-f2a-gch1-p2a-th；

54、39)th-t2a-gch1-(g4s)3-aadc；

55、40)gch1-e2a-th-(g4s)3-aadc；

56、41)th-e2a-gch1-(g4s)3-aadc；

57、42)th-t2a-gch1-e2a-aadc；

58、43)aadc-f2a-gch1-f2a-th；

59、44)th-f2a-gch1-(g4s)3-aadc；

60、45)gch1-(g4s)3-th-(g4s)3-aadc；

61、46)th-(g4s)3-gch1-f2a-aadc；

62、47)th-e2a-gch1-t2a-aadc；

63、48)aadc-p2a-th-(g4s)3-gch1；

64、49)th-(g4s)3-gch1-(g4s)3-aadc；

65、50)aadc-f2a-th-(g4s)3-gch1；

66、51)th-f2a-aadc-f2a-gch1；

67、52)th-(g4s)3-aadc-t2a-gch1；

68、53)th-(g4s)3-aadc-e2a-gch1；

69、54)aadc-p2a-gch1-(g4s)3-th；

70、55)th-f2a-aadc-(g4s)3-gch1；

71、56)aadc-f2a-gch1-(g4s)3-th；

72、57)th-p2a-aadc-f2a-gch1；

73、58)th-p2a-aadc-(g4s)3-gch1；

74、59)gch1-(g4s)3-th-p2a-aadc；

75、60)th-t2a-aadc-(g4s)3-gch1；

76、61)th-t2a-aadc-e2a-gch1；

77、62)gch1-(g4s)3-th-f2a-aadc；

78、63)th-e2a-aadc-(g4s)3-gch1；

79、64)aadc-e2a-gch1-t2a-th；

80、65)gch1-p2a-th-f2a-aadc；

81、66)th-(g4s)3-aadc-(g4s)3-gch1；

82、67)th-e2a-aadc-t2a-gch1；

83、68)gch1-p2a-aadc-f2a-th；

84、69)aadc-t2a-th-(g4s)3-gch1；

85、70)aadc-t2a-gch1-e2a-th；

86、71)th-f2a-aadc-p2a-gch1；

87、72)aadc-e2a-th-(g4s)3-gch1；

88、73)aadc-p2a-gch1-f2a-th；

89、74)th-(g4s)3-aadc-f2a-gch1；

90、75)aadc-p2a-th-f2a-gch1；

91、76)aadc-(g4s)3-th-p2a-gch1；

92、77)aadc-t2a-th-e2a-gch1；

93、78)aadc-(g4s)3-th-e2a-gch1；

94、79)aadc-e2a-th-t2a-gch1；或

95、80)aadc-(g4s)3-th-f2a-gch1。

96、在一些优选的实施方案中，本发明的aav载体包含与seq id no:19-21中任一项具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。

97、在一些实施方案中，本发明的aav载体还包含可操作地连接至编码th、gch1和aadc的核酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子选自：cbh启动子、嵌合型突触蛋白i(synapsin i)启动子、cmv启动子、cag启动子、cagg启动子或casi启动子。在一些实施方案中，启动子包含与seq id no:1-6中任一项具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些优选的实施方案中，启动子包含seq id no:1-3中任一项所示的核酸序列。在一些更优选的实施方案中，启动子包含seq id no:1所示的核酸序列。

98、在一些实施方案中，本发明的aav载体还包含选自kozak序列、sv40病毒的聚腺苷酸化信号(sv40 poly a)和反向末端重复(itr)的一个或多个元件。

99、在第二方面，本发明提供了aav病毒颗粒，其包含根据本发明第一方面的aav载体，以及衣壳蛋白。在一些实施方案中，aav病毒颗粒的衣壳蛋白来源于选自以下血清型的aav：aav5、aav9、aavphp.eb、aavphp.s或aavphp.b。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与seq idno:33-37中任一项具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，衣壳蛋白包含选自seq id no:34或37所示的氨基酸序列。在一些更优选的实施方案中，衣壳蛋白包含seq id no:34所示的氨基酸序列。

100、在第三方面，本发明提供了组合物，其包含本发明第一方面的aav载体和编码衣壳蛋白的包装质粒，以及任选的辅助质粒。

101、在一些实施方案中，包装质粒还包含编码rep蛋白的核酸序列，其中rep蛋白来源于具有aav2或aavphp.b血清型的aav。在一些实施方案中，rep蛋白包含与seq id no:45或seq id no:46具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，rep蛋白包含与seq id no:46具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

102、在一些实施方案中，组合物中的包装质粒包含与seq id no:24-28中任一项具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在一些优选的实施方案中，包装质粒包含选自seq id no:25或28所示的核酸序列。在一些更优选的实施方案中，包装质粒包含seq id no:25所示的核酸序列。

103、在一些实施方案中，辅助质粒包含与seq id no:29具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。

104、在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

105、在第四方面，本发明提供了包含本发明第二方面的aav病毒颗粒，以及任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。

106、在第五方面，本发明提供了细胞，其包含根据本发明第一方面的aav载体、第二方面的aav病毒颗粒、第三方面或第四方面的组合物。

107、在一些实施方案中，所述细胞为神经细胞，按功能区分，所述神经细胞选自：抑制性神经元(优选地，所述细胞为中棘神经元、中间神经元)、兴奋性神经元(优选地，所述细胞为多巴胺能神经元)、小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞或施旺细胞。在一些优选的实施方案中，按脑区区分，所述细胞为中脑纹状体神经元和胶质细胞。

108、在第六方面，本发明提供了根据本发明第一方面的aav载体、第二方面的aav病毒颗粒、第三方面或第四方面的组合物以及第五方面的细胞在制备用于预防和/或治疗受试者多巴胺缺陷引起的疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，疾病为帕金森病。