一种从植物中钓取小肽用于实现不同种属植物间远缘杂交的方法

本发明涉及植物育种，具体地说，涉及一种从植物中钓取小肽用于实现不同种属植物间远缘杂交的方法。

背景技术：

1、农作物育种的一个重要手段是远缘杂交，即通过杂交手段将一些与农作物亲缘关系较远的物种中的重要农艺性状转入农作物中，如抗病、抗虫、高产、耐受干旱或高盐等。有多种方法可以达到远缘杂交的目的，其中一种方法是通过有性生殖来实现的，这种方法要克服物种间的多重生殖隔离障碍，其中首要困难是远缘物种的花粉(父本)在农作物(母本)的柱头上不能萌发生长，或农作物的花粉不能在远源物种柱头上萌发生长，因而无法完成后续的受精过程。

2、20世纪50年代苏联学者米丘林及米丘林学派的学者发现将母本植物的同种花粉与远缘物种花粉混合可以促进远缘杂交，在该技术中母本植物的同种花粉被称为蒙导花粉，这种同种花粉对异种花粉萌发的促进效应被称为蒙导效应。该效应被用于多种植物的远缘杂交育种实践，如杨属植物种间杂交、柳属亚属间杂交、十字花科种间杂交等。

3、但混合花粉技术的问题是会产生大量母本物种自身花粉完成受精作用的种子，给筛选由杂交产生的种子带来很大的困难。因此60年代科学家研发出多种使得母本花粉失去活性但仍保持其蒙导效应的方法，包括伽马辐射、甲醇等溶剂处理、提取花粉外壁蛋白及脂类和反复冻融等。其中伽马辐射是使用最为广泛的方法，这种方法是将蒙导花粉先经过离子辐射等方法处理后再使用，其可以抑制花粉中生殖核的有丝分裂，使得蒙导花粉失去授精能力。伽马辐射和反复冻融等方法需要同时保证两个条件，即雄配子失去受精能力但仍保持蒙导效应。这使得处理计量和时间均需要精确控制，增加了处理的难度，降低了蒙导的成功率。因此前人在利用这些处理方法克服杂交障碍时，经常出现失败的情况。甲醇处理后的蒙导花粉失去活力，不能萌发，而其花粉外壁的大分子最大程度的得到保留，然而此类提取方法，花粉外壁分子的浓度和成分难以精确控制，因而对于使用的量无法精确定量，重复性和推广性较差。

4、因此，需要对远缘杂交技术进行进一步研究。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种促进远缘植物杂交的新方法。

2、为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明公开了一种从植物中钓取肽的方法，所述肽具有促进植物远缘杂交的功能，所述方法包括：

4、(1)从在母本植物花粉和/或花粉管中表达的肽中，获取长度小于160个氨基酸、n端包含一段分泌信号肽且除所述分泌信号肽外的肽段包含4-16个半胱氨酸残基的所有肽，作为候选肽；

5、(2)分别检测步骤(1)中所获得的所有候选肽是否具有促进远缘杂交的功能，若有，则所述候选肽为目标肽。

6、本发明研究发现，在母本植物花粉或花粉管中表达的一类特定结构的肽可具有促进远缘杂交的功能，进而提出了从母本植物中通过特定筛选标准钓取上述肽的方法。

7、本发明中所指分泌信号肽的特征为本领域公知常识，具体为：信号肽序列可划分为n区，h区和c区，n区长度具有多样性，平均长度为5个氨基酸，特征为包含碱性氨基酸(如，精氨酸、赖氨酸)，带有正电荷；h区即疏水区，包含有7-15个疏水性氨基酸残基(如，亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸)；靠近信号肽蛋白酶切割位点的c区包含有5-6个氨基酸，包括极性较强的氨基酸残基(如，谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺)。

8、本发明候选肽中，半胱氨酸残基在除分泌信号肽外的肽段中的位置不限，不同家族候选肽中在除分泌信号肽外的肽段所含半胱氨酸残基的具体数目相同或不同。

9、远缘杂交指植物分类上不同种、属或亲缘关系更远的物种间的杂交。远缘植物指相对某一植物，在植物分类上不同种、属或亲缘关系更远的植物。

10、本发明步骤(2)的具体检测方法为：将每个所述候选肽的n端的分泌信号肽去除后分别施加在母本植物的柱头乳突细胞上，再以远缘植物的花粉授粉，观察所述候选肽是否具有促进所述远缘植物的花粉管穿过所述母本植物的柱头，实现远缘杂交的功能。

11、本发明中，所述母本植物是管粉受精植物，优选是自交亲和、具有干柱头的植物。

12、本发明所发现的识别机制中涉及的小肽和受体在陆生植物中广泛存在，这个机制介导的花粉管穿过柱头的过程也广泛存在，因此本发明所发现的方法可适用于管粉受精植物。

13、本领域技术人员可根据本发明上述钓取方法实现目标肽的获取，具体可将每一个按步骤(1)规则获得的候选肽的分泌肽段序列去除后进行人工合成，然后逐一进行效果验证。

14、但为了提升钓取效率，优选本发明方法在进行步骤(2)的检测之前，还包括确定所有候选肽的检测顺序的步骤，具体包括：

15、①根据所述母本植物的全基因组数据，分别构建每个所述候选肽所属基因家族的系统发生树；

16、②获取所有候选肽的表达量数据，将所有候选肽中在花粉中表达量最高的候选肽作为第一个候选肽，在步骤①构建的包含所述第一个候选肽的系统发生树上观察与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽是否在花粉和/或花粉管中表达，若与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽仅有一个且在花粉和/或花粉管中表达，则将该个与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽与所述第一个候选肽共同组成第一候选肽单系分支a；若与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽仅有一个且在花粉和花粉管中均不表达时，则仅将所述第一个候选肽作为首先进行步骤(2)检测的对象，并在包含所述第一个候选肽的系统发生树上或在步骤①构建的所有系统发生树中查找在花粉中表达量第二的候选肽作为第二个候选肽，按与对待所述第一个候选肽的方法进行处理；

17、若与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽有多个，当多个与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽中存在一个候选肽在花粉和花粉管中均不表达时，则仅将所述第一个候选肽作为首先进行步骤(2)检测的对象，并在包含所述第一个候选肽的系统发生树上或在步骤①构建的所有系统发生树中查找在花粉中表达量第二的候选肽作为第二个候选肽，按与对待所述第一个候选肽的方法进行处理；当多个与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽均在花粉和/或花粉管中表达时，则将所述多个与所述第一个候选肽亲缘关系最近的候选肽与所述第一个候选肽共同组成第一候选肽单系分支a；

18、若获得了第一候选肽单系分支a，则继续在步骤①构建的包含所述第一个候选肽的系统发生树上观察与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽是否在花粉和/或花粉管中表达，若与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽仅有一个且在花粉和/或花粉管中表达，则将该个与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽与所述第一候选肽单系分支a中的候选肽共同组成第一候选肽单系分支b；若与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽仅有一个且在花粉和花粉管中均不表达时，则将所述第一个候选肽单系分支a中的候选肽作为首先进行步骤(2)检测的对象，并在包含所述第一个候选肽的系统发生树上或在步骤①构建的所有系统发生树中查找在花粉中表达量第二的候选肽作为第二个候选肽，按与对待所述第一个候选肽的方法进行处理；

19、若与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽有多个，当多个与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽中存在一个候选肽在花粉和花粉管中均不表达时，则将所述第一个候选肽单系分支a中的候选肽作为首先进行步骤(2)检测的对象，并在包含所述第一个候选肽的系统发生树上或在步骤①构建的所有系统发生树中查找在花粉中表达量第二的候选肽作为第二个候选肽，按与对待所述第一个候选肽的方法进行处理；当多个与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽均在花粉和/或花粉管中表达时，则将所述多个与所述第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的候选肽与所述第一候选肽单系分支a中的候选肽共同组成第一候选肽单系分支b；

20、若获得了第一候选肽单系分支b，则继续按获得第一候选肽单系分支b的方法判断是否可由第一候选肽单系分支b扩充获得第一候选肽单系分支c，依此类推，直至出现无法进一步扩充含有所述第一个候选肽的第一候选肽单系分支中候选肽数量的情况，获得含有所述第一个候选肽的最终第一候选肽单系分支，将最终第一候选肽单系分支中的候选肽作为首先进行步骤(2)检测的对象；

21、在包含所述第一个候选肽的系统发生树中或在步骤①构建的所有系统发生树中，按候选肽在花粉中表达量高低，对除所述第一个候选肽外或未包含在所述最终第一候选肽单系分支中的所有剩余候选肽依照对待所述第一个候选肽的方法进行处理，依次获得进行步骤(2)检测的后续对象。

22、当以最终第一候选肽单系分支中的候选肽作为首先进行步骤(2)检测的对象时，最终第一候选肽单系分支中的各候选肽之间检测的顺序可以是任意的，也可以根据最终第一候选肽单系分支中的各候选肽在花粉中表达量的高低顺序进行。

23、由于一个肽的功能与其和其他肽的亲缘关系和表达量均具备一定的关联，故本发明通过在母本植物的全基因组中，将所有候选肽按家族构建各自的系统发生树，来明确各候选肽的亲缘关系，并按照各候选肽在花粉中表达量由高到低，结合候选肽亲缘关系的远近来对各候选肽进行归组排序，从而确定出进行步骤(2)检测的顺序，以便提升钓取目标肽的效率。

24、本发明中“亲缘关系最近”指在系统发生树上离的最近的分支。

25、为了进一步提升钓取目标肽的效率，本发明方法进一步优选在确定了所有候选肽的检测顺序后，先根据所有候选肽的检测顺序，对所有候选肽的功能进行分析筛选，之后再以筛选获得的候选肽进行步骤(2)的检测，功能分析方法具体包括：

26、①若仅所述第一个候选肽为首先进行步骤(2)检测的对象，则构建所述第一个候选肽突变的母本植物的单突突变体，初步验证所述单突突变体的功能；若所述最终第一候选肽单系分支为首先进行步骤(2)检测的对象，则构建所述最终第一候选肽单系分支中所有候选肽同时突变的母本植物的高阶突变体，初步验证所述高阶突变体的功能；

27、初步验证所述单突突变体或所述高阶突变体功能的方法为：用所述单突突变体或所述高阶突变体的花粉授粉野生型母本植物的柱头，若出现目标表型，则将所验证的突变体中相比野生型母本植物突变的所有候选肽作为初筛目标肽；若未出现目标表型，则将所验证的突变体中相比野生型母本植物突变的所有候选肽排除，不再进行步骤(2)的检测；所述目标表型为相比野生型花粉管，所述单突突变体或所述高阶突变体的花粉管穿过野生型母本植物柱头的比例和/或速度存在显著性下降；

28、②初筛目标肽回补实验：

29、对于通过单突突变体初步验证获得的初筛目标肽，将所述通过单突突变体初步验证获得的初筛目标肽回补到初筛获得该初筛目标肽时所用的单突突变体中，获得回补植物进行复筛验证；

30、对于通过同一个高阶突变体同时初步验证获得的多个初筛目标肽，则将所述多个初筛目标肽中的任意一个回补到初筛获得该多个初筛目标肽时所用的高阶突变体中，获得回补植物进行复筛验证；

31、所述复筛验证的方法为：将所述回补植物的花粉授粉野生型母本植物的柱头，若相比回补前的单突突变体或高阶突变体的花粉，回补植物的花粉管穿过野生型母本植物柱头的比例和/或速度存在显著性回升，则将所验证的所述通过单突突变体初步验证获得的初筛目标肽或通过同一个高阶突变体同时初步验证获得的所有初筛目标肽中的一个或多个作为进行步骤(2)检测的候选肽；

32、优选，当通过同一个高阶突变体同时初步验证获得的所有初筛目标肽中，存在多个初筛目标肽功能冗余时，则以存在功能冗余的所述多个初筛目标肽中的任意一个作为进行步骤(2)检测的候选肽，所获得的步骤(2)的检测结果代表存在功能冗余的所述多个初筛目标肽；当通过同一个高阶突变体同时初步验证获得的所有初筛目标肽中，不存在多个初筛目标肽功能冗余时，则所述通过同一个高阶突变体同时初步验证获得的所有初筛目标肽均作为进行步骤(2)检测的候选肽；

33、若相比回补前的单突突变体或高阶突变体的花粉，回补植物的花粉管穿过野生型母本植物柱头的比例和速度均不存在显著性回升，则将所验证的所述通过单突突变体初步验证获得的初筛目标肽或通过同一个高阶突变体同时初步验证获得的所有初筛目标肽排除，不再进行步骤(2)的检测；

34、依此类推，根据所有候选肽的检测顺序，对所有候选肽的功能进行分析筛选。

35、本发明中肽的功能冗余指在基因组中两个或两个以上的小肽具有相同的生物学功能，当其中一个基因出现缺失或发生突变时，其他基因仍可以发挥相同的功能，在对某个生物学过程的调控中表现出剂量效应。功能冗余的判定方法为本领域公知常识，具体可参见láruson et al.,2020(doi：10.1016/j.tree.2020.04.009)的记载。通过功能冗余的判断可帮助提升目标肽钓取效率。

36、通过候选肽的突变(基因功能缺失)和回补实验，可实现候选肽功能的初步判断，因此采用本发明的功能分析方法可进一步减少步骤(2)检测的工作量，提升钓取肽的效率。

37、当然，本领域技术人员应当理解的是，采用对候选肽排序和功能分析的方法仅是为了提升钓取工作的效率，本领域技术人员也可直接将所有步骤(1)获得的候选肽，依次进行步骤(2)的验证，以获得目标肽。

38、本发明可通过rna-seq、信号肽预测等本领域常规技术手段，在母本植物中找到在花粉和/或花粉管中表达的、富含半胱氨酸且具有预测的分泌信号肽的小肽(小于160个氨基酸)；然后，将小肽进行人工合成后，检测其是否具有促进远缘植物花粉穿过柱头，实现远缘杂交的功能，从而最终钓取获得本发明的具有促进远缘杂交功能的肽。

39、本发明具体钓取方法以及后续功能研究的方法和难点在于：

40、1、获得杂交所使用的母本植物的花粉和花粉管的rna-seq数据时花粉和花粉管材料的收集、获取不易。具体如下：

41、针对花粉：因为花粉非常小，为了获得花粉的转录组数据，需要采集大量的花。将母本植物成熟的花取到离心管中，大约需采集1-2ml的花，在液体的花粉萌发培养基中振荡，离心后去掉花瓣和雌蕊等组织，分离获得成熟花粉。然后再使用植物rna提取试剂盒，提取其rna。

42、针对花粉管：为了获得花粉管的转录组数据，首先通过上述方法收集成熟花粉粒，再将花粉粒在液体的花粉萌发培养基中萌发，收集萌发后的花粉管，以微量组织rna提取试剂盒提取rna，提取后的rna经过反转录和扩增后进行测序。

43、2、肽的筛选

44、获得花粉和花粉管的rna-seq数据后，和植物的基因组序列及注释文件进行比对、注释，确定样品中不同基因的相对表达量。根据信号肽的特征找到n端包含一段分泌信号肽的小肽。根据基因注释信息，从基因相对表达量的列表文件中找出其中所有富含半胱氨酸的小肽(除所述分泌信号肽外的肽段包含4-16个半胱氨酸残基，长度小于160个氨基酸)的基因。此步骤会获得众多候选肽，每个肽根据其序列特征，分属于不同的小肽家族。

45、本发明在进行生物信息学分析时，需要保证测序的目标物种具有参考基因组和比较准确的基因注释信息，除此之外还需从大量的基因里找到符合标准的小肽基因。

46、此时可直接逐一将所获得的小肽进行是否具有促进远缘杂交功能的检测。但为了提升钓取效率，优选进行下述步骤3。

47、3、系统发生分析(即，确定候选肽验证顺序)

48、对步骤2中筛选到的小肽家族进行分析，使用小肽的氨基酸全长序列根据小肽来源植物全基因组信息构建各小肽家族的系统发生树，先找寻在花粉中表达量最高的小肽，作为第一个候选肽。之后在其所属小肽家族系统发生树上观察与所述第一个候选肽亲缘关系最近的基因是否在花粉和/或花粉管中表达，若在，将后者与第一个候选肽组成第一候选肽单系分支a，且继续观察与第一候选肽单系分支a亲缘关系最近的基因是否在花粉和/或花粉管中表达，若在，则将其与第一候选肽单系分支a共同组成第一候选肽单系分支b，依此类推，直至亲缘关系最近的基因既不在花粉中表达也不在花粉管中表达时停止对第一候选肽单系分支中候选肽数量的扩充(若亲缘关系最近的基因为多个，则只要有其中一个基因在花粉和花粉管中均不表达时，则停止对第一候选肽单系分支中候选肽数量的扩充)；再观察第一个候选肽所在家族或所有候选肽家族中尚未进行考量过的所有小肽，以在花粉中表达量第二高的肽作为第二个候选肽，并根据上述方法判断是否需要将其亲缘关系近的基因与其共同组成第二候选肽单系分支；依据花粉中小肽表达量的高低依次按上述步骤观察处理所有小肽。

49、优选，对于花粉表达的小肽的研究较为深入的植物(如拟南芥)，可采用先以一个小肽家族为单位，按照花粉中表达量高低依次进行考量的方式。对于花粉表达的小肽的研究尚不深入的植物，可在所有小肽家族的系统发生树中按照在花粉中表达量高低依次进行考量。

50、本发明依上述方式对所有小肽进行排序，从而获得了一个候选小肽(基因)列表，其包含了来自不同家族的小肽，每个家族的小肽是来自单系，即同一支的(可能包含若干个小肽)且均在花粉和/或花粉管中表达。

51、此时可直接将排序后的小肽逐一进行是否具有促进远缘杂交功能的检测，对于列表中同在一个单系分支中的小肽，它们之间的检测顺序先后可以是任意的，也可以优选根据它们各自在花粉中的表达量高低，优先检测表达量高的小肽。

52、但为了提升钓取效率，优选进一步进行下述步骤4。

53、4、对候选肽进行功能分析

54、按照步骤3中获得的列表顺序对众多候选小肽进行功能分析，具体从以下方面入手。

55、其一是遗传方面，即构建小肽基因功能缺失突变体。从已有的突变体库中查找或使用crispr技术，构建每类小肽的单突突变体和/或高阶突变体(指在同一个植株中将多个基因同时突变)，然后用突变体的花粉授粉本物种(指小肽来源物种)的柱头。如果这类小肽可以作为“钥匙”打开柱头处的生殖隔离屏障的话，那这些突变体中“钥匙”的缺失会导致本物种花粉管穿过本物种柱头的能力下降(目标表型)，从而根据突变体的表型可以初步筛选到目标小肽(初筛目标小肽)。

56、具体地，按照所确定的候选肽验证顺序进行小肽的验证。

57、若所述第一个候选肽不存在与其亲缘关系最近且在花粉和/或花粉管中表达的同源基因，则仅构建该小肽的单突突变体，进行验证。若所述第一个候选肽存在与其亲缘关系近且在花粉和/或花粉管中表达的同源基因，则构建高阶突变体，观察高阶突变体是否具有目标表型。若高阶突变体具有目标表型，则第一个候选肽及其亲缘关系近的同源基因均为初筛目标肽；若未出现目标表型，则排除第一个候选肽所在的单系分支，按在花粉中表达量高低继续验证该家族其他候选肽；若在该家族小肽的突变体中未出现目标表型，则代表该家族小肽均非初筛目标小肽，则按在花粉中表达量高低，对其他小肽家族进行功能验证；或者在完成第一个候选肽判定后，按在花粉中表达量高低在所有家族中选择下一个候选肽作为考量对象；

58、其二是对初筛目标小肽进行回补实验验证。具体对于通过单突突变体筛选确认的初筛目标小肽，直接将其回补到对应的单突突变体中进行验证，对于通过高阶突变体筛选确认的初筛目标小肽，则从每个高阶突变体中任选一个之前敲除(突变)的基因，回补到该高阶突变体中进行验证，此验证结果可代表同一高阶突变体中的所有小肽。具体验证方法同上，即用突变体的花粉授粉本物种的柱头，若本物种花粉管穿过本物种柱头的能力有所恢复，则判定初筛目标小肽为待检测候选肽。

59、进行回补实验后可初步判断初筛目标小肽的功能，优选对于通过高阶突变体筛选确认的多个初筛目标小肽，还可通过功能冗余的分析判断，仅以功能冗余的初筛目标小肽中的任意一个作为待检测候选肽，进行最终功能确认，来代表所有功能冗余的初筛目标小肽的功能确认结果。

60、在进行众多候选基因验证时，工作复杂，若单个小肽的突变没有表型，并不代表这个小肽没有功能，而很可能是还有其他小肽成员执行着同样的功能，因此在遗传方面，需要进一步构建高阶突变体来观察表型。

61、5、最终功能确认

62、检测上述确认的候选肽是否具有促进远缘植物的花粉穿过杂交母本植物的柱头，实现远缘杂交的功能。首先，将待检测小肽n端的分泌信号肽段去除后进行人工合成，配置肽溶液处理本物种的柱头，观察处理之后哪个小肽可以促进原本难以穿过本物种柱头的异种花粉穿过柱头。

63、优选地，在人工合成小肽后的验证处理实验中，可通过设计多个浓度，改变处理次数等来确认小肽最终优选的应用方式。

64、本发明通过上述方法发现了在远缘杂交中的母本植物的花粉和/或花粉管中分泌的一类信号分子(小肽)，当向母本植物的柱头施加人工合成的这类信号分子后，这类分子可以作为“钥匙”打开由该母本植物柱头建立的生殖障碍，帮助不同属物种的花粉管穿过该母本植物的柱头，进而获得远缘杂交的杂交胚胎。该发现不但从理论上首次阐明了蒙导效应的分子机制，还可以用于提高农作物与其远缘物种的杂交效率，解决长期困扰农作物育种学家的远缘杂交问题。

65、通过上述方法可在不同母本植物中钓取获得能相应打破该母本植物远缘杂交生殖障碍的肽。

66、第二方面，本发明公开了一条肽，其由上述方法钓取得到。

67、第三方面，本发明还依据上述方法从拟南芥中钓取了七条肽，均属于富含半胱氨酸的小肽，肽的n端包含一段分泌信号肽，n端信号肽被剪切后，形成成熟肽，成熟肽(除所述分泌信号肽外的肽段)包含4个半胱氨酸残基，可形成二硫键。七条肽分别为atralf10，全长73个氨基酸，成熟肽长度为56个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.14所示；atralf11，全长72个氨基酸，成熟肽长度为55个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.15所示；atralf12，全长72个氨基酸，成熟肽长度为55个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.16所示；atralf13，全长72个氨基酸，成熟肽长度为55个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.17所示；atralf25，全长74个氨基酸，成熟肽长度为52个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.18所示；atralf26，全长76个氨基酸，成熟肽长度为54个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.1所示；atralf30，全长76个氨基酸，成熟肽长度为54个氨基酸；其氨基酸序列如seq idno.19所示。

68、本发明的肽，可打破以其钓取来源植物作为远缘杂交母本时的生殖障碍，促进杂交效率。

69、本发明的肽可人工合成，制作过程简单，操作容易，可大规模应用。

70、第四方面，本发明公开了上述肽在实现不同种或属植物远缘杂交中的应用，所述肽钓取自远缘杂交的母本植物中。

71、序列为seq id no.1、14-19所示的肽，由于其钓取自拟南芥中，故其可应用于以拟南芥作为母本植物的远缘杂交中。

72、本发明可采用对母本植物施用肽的技术来实现远缘杂交，所述肽是从母本植物中以上述方法钓取获得的。该方法无需如现有技术中记载的那样，使用母本物种花粉，避免了母本物种自交产生的种子，提高了远缘杂交产生杂交后代的效率。

73、第五方面，本发明公开一种实现不同种或属植物远缘杂交的方法，其在母本植物的花期中，于所述母本植物的柱头乳突细胞上施加目标肽后，再以父本植物的花粉授粉；所述目标肽由上述方法从所述母本植物中钓取得到。

74、本发明中，父本植物的花粉需为成熟花粉。优选，当父本花药饱满且开裂时，进行取用。

75、本发明的方法中，所述母本植物是管粉受精植物，优选是自交亲和、具有干柱头的植物；所述父本植物与所述母本植物的种或属不同。

76、更优选，本发明的方法中，所述母本植物是禾本科植物、十字花科植物或经过遗传改造后变为自交亲和的其他科属植物，进一步优选为水稻、小麦、玉米、高粱、白菜、萝卜或油菜。

77、本发明的方法中，于所述母本植物花药成熟前对所述母本植物进行去雄，避免母本植物自身花粉的污染。

78、本发明的方法中，每个所述母本植物的柱头乳突细胞上施加目标肽的量(以拟南芥为例)为300ng-2000ng；

79、本发明的方法中，分多次对所述母本植物的柱头乳突细胞施加目标肽，每次施加完毕后，待所述柱头乳突细胞干燥后，再进行下一次施加，最后一次施加完毕后，待所述柱头乳突细胞干燥后立即进行授粉。

80、作为一个具体实施方式，本发明肽的施加方式为：用移液器或注射器将小肽溶液滴加在母本柱头表面，共滴加两次，每次间隔10-15min，第二次滴加等柱头干燥后立即授杂交父本花粉。

81、本发明的方法中，所述目标肽施加在所述母本植物的盛开的花朵的柱头乳突细胞上，以保证母本柱头处在最佳状态，提升杂交效率。

82、本发明肽的施加优选在母本植物花朵盛开的时间段进行，根据母本植物种类的不同，具体时间有所差异，如拟南芥为8:00-14:00，水稻为10:00-12:00，本领域技术人员可根据本领域常识进行时间段选择。

83、本发明的有益效果至少在于：

84、本发明创新地将以特定方法钓取到的母本物种花粉和/或花粉管分泌的特异信号分子用于母本物种与远缘物种的杂交育种，以获得杂交后代。通过该杂交手段可将一些远源物种(不同种或属物种)中的重要农艺性状转入农作物中，如抗病、高产、耐受高温或低温等。避免了传统花粉蒙导过程中，筛选杂种困难或因需精确控制而导致的处理难度大、成功率低的问题

85、本发明所用肽可通过化学合成获得，获得途径简单，且产物稳定；使用的方法操作简单，成功率高。