一种突变杀虫蛋白Vip3及其应用的制作方法

本发明涉及生物，更具体地说，本发明涉及一种突变杀虫蛋白vip3及其应用。

背景技术：

1、农业害虫是影响农作物生产的第一大重要因素，随着转基因技术的快速发展，通过转化bt(bacillus thuringiensis)杀虫蛋白基因产生昆虫抗性植物的能力给现代农业带来了革命，并提高了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。已有数种bt蛋白用于产生昆虫抗性的转基因植物中，包括cry1ab蛋白、cry1ac蛋白、cry1 f蛋白、cry2ab蛋白、cry3bb蛋白和vip3a蛋白等。然而随着转基因作物的推广应用，仍迫切需要获得表达量高、抗虫效果好的转基因植物。

技术实现思路

0、发明简述

1、为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种突变杀虫蛋白vip3，其包含与任一vip3家族蛋白氨基酸序列相比具有下述突变的氨基酸序列：在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸突变为其他任一氨基酸和/或第14位氨基酸突变为其他任一氨基酸。

2、在一个具体实施方式中，所述的突变杀虫蛋白vip3，包含与任一vip3家族蛋白氨基酸序列相比具有下述突变的氨基酸序列：在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸；和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

3、在一个具体实施方式中，所述vip3家族蛋白氨基酸序列如seq id no:4、seq idno：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18、seq id no：20、seq id no：22、seq idno：24、seq id no：26、seq id no：28或seq id no：30所示。

4、在一个具体实施方式中，所述的突变杀虫蛋白vip3，其包含与任一vip3家族蛋白氨基酸序列相比具有下述突变的氨基酸序列：

5、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为谷氨酰胺；

6、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为天冬氨酸；

7、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为天冬酰胺；

8、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸；

9、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸；

10、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为酪氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为赖氨酸；

11、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为缬氨酸；

12、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为组氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为谷氨酰胺；

13、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为组氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为天冬氨酸；

14、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为半胱氨酸；

15、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为甘氨酸；

16、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为色氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为苏氨酸；

17、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为天冬氨酸；

18、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为异亮氨酸；

19、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为丙氨酸；

20、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为组氨酸；

21、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为天冬酰胺和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为谷氨酰胺；

22、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为谷氨酰胺和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为组氨酸；

23、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为蛋氨酸；

24、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为天冬氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为苯丙氨酸；

25、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为组氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为赖氨酸；

26、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为蛋氨酸；

27、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为谷氨酸；

28、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为异亮氨酸；

29、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为天冬氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为甘氨酸；

30、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为谷氨酰胺和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为缬氨酸；

31、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为甘氨酸；

32、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为甘氨酸；

33、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸；

34、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸和/或第14位氨基酸由脯氨酸突变为蛋氨酸；

35、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突变为组氨酸；

36、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第12位氨基酸由丙氨酸突苏氨酸；

37、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为半胱氨酸；

38、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为缬氨酸；

39、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为丙氨酸；

40、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为天冬氨酸；

41、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为谷氨酸；

42、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为苯丙氨酸；

43、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为组氨酸；

44、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为异亮氨酸；或者，

45、在对应于seq id no:4所示的氨基酸序列中的第14位氨基酸由脯氨酸突变为赖氨酸。

46、在另一个具体实施方式中，所述的突变杀虫蛋白vip3的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：27或seq id no：29、seq id no：41-80所示。

47、本发明还提供一种分离的多核苷酸，其中包含编码所述突变杀虫蛋白vip3的核酸序列或者其互补序列。

48、在一个具体实施方式中，所述的多核苷酸是dna、rna或者其杂合体。

49、在一个具体实施方式中，所述的多核苷酸是单链的或双链的。

50、在一个具体实施方式中，所述的多核苷酸具有选自下述的核酸序列：

51、(1)编码如seq id no：1、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq idno：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：27或seqid no：29、seq id no：41-80所示氨基酸序列的核酸序列或其互补序列；

52、(2)如seq id no：2、seq id no：31-40、seq id no：81-120任意一项所示的核酸序列或其互补序列；

53、(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列；和/或

54、(4)因遗传密码的简并性而与(1)或(2)所示序列编码相同氨基酸序列的核酸序列，或其互补序列。

55、在另一个具体实施方式中，所述核酸序列被优化用于在植物细胞中表达。

56、本发明还提供一种表达载体，其中包含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的表达调控元件。

57、本发明还提供一种表达载体，其中包含表达如所述突变杀虫蛋白vip3和pat的基因串联表达框。

58、在一个具体实施方式中，所述基因突变杀虫蛋白vip3核苷酸序列为seq id no：2、seq id no：31-40、seq id no：81-120任意一项所示，所述基因pat核苷酸序列为seq idno：6。

59、在另一个具体实施方式中，所述基因串联表达框还包含：

60、核苷酸序列如seq id no：5所示的启动pat表达的启动子camv 35s promoter、核苷酸序列如seq id no：7所示的终止该基因表达的终止序列camv poly(a)signal；

61、核苷酸序列如seq id no：8所示的启动突变杀虫蛋白vip3表达的启动子osubi2promoter、核苷酸序列如seq id no：3所示的叶绿体导肽ctp-ts-ssu、核苷酸序列如seq id no：9所示的终止该基因表达的终止子t-ara5。

62、在另一个具体实施方式中，所述表达载体的核苷酸序列如seq id no：10所示。

63、本发明还提供一种宿主细胞，其中包含有所述的多核苷酸或所述的表达载体。

64、在一个具体实施方式中，所述的宿主细胞是植物细胞。

65、本发明还提供一种培育具有或提升了抗虫能力的转基因植物的方法以及通过所述方法所生产的植物，其中包括将所述的植物细胞再生成植物。

66、本发明还提供所述的表达载体或所述的宿主细胞在提高植物抗虫特性、制备具有抗虫效果的药剂或者培育具有或提升了抗虫能力的转基因植物上的应用。

67、本发明还提供一种管理昆虫抗性或控制昆虫的方法，其包括将昆虫至少与上述植物接触，所述昆虫通过摄食所述植物的组织至少与所述突变杀虫蛋白vip3接触，接触后所述昆虫生长受到抑制和/或导致死亡，从而实现管理所述昆虫的抗性或实现对所述昆虫危害植物的控制。

68、在一个具体实施方式中，所述的植物为玉米、棉花或大豆。

69、在一个具体实施方式中，抗虫为抗鳞翅目或昆虫为鳞翅目。

70、本发明通过对原始的vip3家族蛋白序列进行点突变获得了对植物细胞毒性降低，可在植物细胞中高表达的突变vip3家族杀虫蛋白，对多种害虫具有优良的杀虫效果。

71、发明详述

72、本说明书中使用的一些术语定义如下。

73、在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶植物。

74、在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

75、在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

76、在本发明中，“宿主生物”应理解为可以引入突变型蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如：细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。

77、术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。

78、本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与vip3aa进行比对而确定的，譬如用smith-waterman运算法则或用clustalw2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照wilbur,w.j.and lipman,d.j.(1983)rapid similarity searches ofnucleic acid and protein data banks.proc.natl.acad.sci.usa,80:726-730中所述的方法进行计算。在clustalw2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝gonnet；蛋白质/dna端隙＝-1；蛋白质/dnagapdist＝4。

79、优选采用alignx程序(vectornti组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10；缺口延伸罚分：0.05)。通过将蛋白质的氨基酸序列与vip3aa进行比对来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。

80、氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，使用可从美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的blast运算法则(altschul et al.,1990,mol.biol.215:403-10)，使用默认参数确定。

81、本领域技术人员还清楚的是，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。

82、因此，本发明的突变型蛋白除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖包含一个或多个其他非保守取代的突变型蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

83、如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的n和/或c末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型蛋白的n和/或c末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型蛋白的生物学活性。例如，突变型蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的n和/或c末端缺失了一个或多个(例如1－50个、1－25个、1－10个或1－5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。

84、术语“vip3家族蛋白”、“vip3家族基因”、“vip3”是基于氨基酸序列的同源性对vip(vegetative insecticidal protein)蛋白分类的结果，包括vip3a、vip3b、vip3c等基因。

85、在一个具体实施方式中，所述vip3家族蛋白氨基酸序列如seq id no:4、seq idno：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18、seq id no：20、seq id no：22、seq idno：24、seq id no：26、seq id no：28或seq id no：30所示。

86、术语"突变"是指相对于正规序列或野生型序列或参考序列，多肽中的单个氨基酸变异和/或核酸序列中的至少单个核苷酸变异。

87、术语“多核苷酸”、"核酸"、"核酸分子"或"核酸序列"可以互换使用，是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸和其片段或部分，其可以是单链或双链，并且表示有义或反义链。核酸包括dna、rna或者其杂交体，并且可以具有天然或合成来源。例如，核酸可包括mrna或cdna。核酸可包括已被扩增(例如，使用聚合酶链反应)的核酸。核苷酸名称"r"意指嘌呤例如鸟嘌呤或腺嘌呤；"y"意指嘧啶例如胞嘧啶或胸腺嘧啶(如果是rna则为尿嘧啶)；"m"意指腺嘌呤或胞嘧啶；"k"意指鸟嘌呤或胸腺嘧啶；以及"w"意指腺嘌呤或胸腺嘧啶。

88、术语“分离”，当提及核酸时，是指这样的核酸，所述核酸与其天然存在于其中的基因组的实质部分分开和/或与天然伴随该核酸的其他细胞组分基本上分离。例如，已经通过合成(如通过连续碱基缩合)而产生的任意核酸被认为是分离的。同样地，重组表达的核酸、克隆的核酸、通过引物延伸反应(例如pcr)产生的核酸或另外切离基因组的核酸也被认为是分离的。

89、本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。

90、术语“转基因”植物是指包含异源多核苷酸的植物。优选地，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得多核苷酸传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独整合到基因组中或作为重组表达盒的一部分整合。“转基因”在本文中用于指任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型由于异源核酸的存在而被改变，包括那些最初被改变的转基因生物体或细胞，以及从初始转基因生物体或细胞杂交或无性繁殖所产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不旨在包括通过常规植物育种方法(例如，杂交)或通过天然发生的事件(如，自体受精、随机杂交受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变基因组(染色体或染色体外)。

91、本文除草剂抗性pat基因和vip3家族基因根据本行业中通用的方法，可以导入植物中，可通过适当的植物转化表达载体进行转基因操作。

92、包括载体在内选用任何适当的启动子是进行植物转基因时行业内通用的方法。例如：在植物转基因中常用的启动子包括但不限于sp6启动子、t7启动子、t3启动子、pm启动子、玉米泛素启动子、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、胭脂氨酸合成酶(nos)启动子、玄参花叶病毒35s启动子、甘蔗杆状的病毒启动子、竹节花黄斑驳病毒启动子、光诱导启动子核酮糖-1，5-酮糖羧化酶(ssrubisco小亚基)、大米胞质磷酸丙糖异构酶(tpi)启动子、拟南芥腺嘌呤转磷酸核糖基酶(aprt)启动子、章鱼碱合成酶启动子和bcb(蓝铜结合蛋白)启动子。

93、植物转基因载体包括可引起3’-端聚腺苷酸化的多聚腺苷酸信号序列。例如，包括但不限于农杆菌的胭脂氨酸合成酶基因的nos 3’-末端衍生物、农杆菌的章鱼碱合成酶基因的章鱼碱合成酶3’–末端衍生物、番茄或马铃薯蛋白酶抵抗剂i或ii基因的3’-末端、camvpoly a信号序列、稻米α-淀粉酶基因3’–末端和菜豆碱基因3’–末端。

94、载体也包括可选择性标记为报道分子的编码基因，可选择性标记的例子包括但不限于抗生素(例如:新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、大观霉素、潮霉素、争光霉素、氯霉素等)或抗除草剂(草甘膦、草铵膦、草胺膦等)基因。

95、载体转化的方法包括使用农杆菌介导转化法、电穿孔、微粒轰击法、聚乙烯乙二醇-介质吸收等方法将重组质粒导入到植物中。

96、本发明中植物转化受体包括植物细胞(包含悬浮培养细胞)、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽和成熟的植物体。

97、转基因植物的范围不仅包括基因导入的当代获得的植物体，还包括它的克隆和后代(t1代、t2代或随后的几代)。本发明的范围还包括上述转基因植物通过杂交和融合后显示出初代转基因植物特点的所有突变体和变体。本发明的范围还包括植物的一部分，如种子、花、茎、果实、叶、根、块茎、块状茎，这些部分来自通过本发明中提及的方法提前进行转基因修饰的植物，或它的后代，至少要由转基因修饰细胞的一部分组成。

98、本发明中所述的“杀虫”或“抗虫”是指对农作物害虫是有毒的，从而实现“控制”和/或“防治”农作物害虫。优选地，所述“杀虫”或“抗虫”是指杀死农作物害虫。上述害虫包括鳞翅目，例如玉米螟和/或草地贪夜蛾。

99、本发明所述的“昆虫生长受到抑制”是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。

100、本发明可以通过多种不同形式实施，实施方法不受本文阐述方法限制。本文的实施个例是为达到彻底和完全效果而提供，行业内人士可充分了解本发明的范围。相同的参考编号在本发明当中指代相同的因素。

101、本文中使用术语是为了描述特定的实施例，不是为了设定限制。除非是文中明确特别指出的内容外，上述内容中英文版本中使用的“a”，“an”和“the”也包含它们的复数形式。本文中使用的术语“组成-comprises”和/或“组成-comprising，”或“包括-includes”和/或“包括-including”特指本文中描述的特点，因素和/或成分的存在，不排除存在和追加一个或多个其他特点，因素和成分。上述内容中使用的术语“和/或”包括所有一个或多个组合清单中的项目。

102、本发明已经通过一系列实施例进行详尽的阐述，但本发明不仅限于已经揭示的实施例。符合本发明范围内的任何数量变动，替换，置换等，本文中未进行阐述，或可根据公众需要进行修改。