静脉血栓风险基因多态性检测引物探针组及其检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种静脉血栓风险基因多态性检测引物探针组及其检测试剂盒，属于生物医学检测。

背景技术：

1、静脉血栓栓塞症(vte)是指血液在静脉内不正常地凝结，使血管完全或不完全阻塞，属静脉回流障碍性疾病。研究显示，多种遗传因素在vte发病中具有非常重要的作用。

2、纤溶酶原激活物抑制物-1(pai-1)是组织型纤溶酶原激活物(t-pa)的快速抑制物。t-pa与pai-1间的动态平衡对维持血浆纤溶系统的稳态起决定性作用，pai-1活性或水平过高是血栓形成的主要原因之一。大量研究表明：pai-1(4g/5g)多态性与纤溶酶原激活物抑制物-1表达增高有关。pai-1 4g/5g多态性与亚洲人静脉血栓(vte)风险增加显著相关。

3、proc编码蛋白c(pc)，是人体重要的生理性抗凝蛋白，proc(574-576del aag)、proc(565c>t)位点基因突变与个体发生vte的风险增加之间存在关联。当pc缺陷(活性降低或表达减少)时，血栓抗凝蛋白缺陷风险增高。proc(574-576del aag)、proc(565c>t)变异会导致pc缺陷，进而增加血栓风险。

4、thbd编码血栓调节蛋白，是凝血酶激活蛋白c抗凝系统的重要成员。血栓调节蛋白的抗凝功能主要体现在协助凝血酶激活蛋白c方面，当血液凝固时，凝血酶激活蛋白c处于无活性状态，需要局部高浓度的凝血酶切割激活肽来激活凝血酶激活蛋白c成为活化的凝血酶激活蛋白c，这一单纯的凝血酶激活过程通常很缓慢，而在辅因子血栓调节蛋白的协助下，凝血酶激活蛋白c的活化速率提高1000倍，高效的产生足够的活化的凝血酶激活蛋白c。当thbd(-151g>t)发生突变时，会导致血栓调节蛋白的表达量减少，从而降低血栓调节蛋白对凝血酶激活蛋白c的抗凝活性的激活。

5、对pai-1、proc(565c>t)、proc(574-576delaag)、thbd(-151g>t)进行基因多态性检测可以评估静脉血栓风险。

6、目前，基因多态性检测方法有很多种，包括直接测序法、芯片法、限制性片段长度多态性法、扩增阻滞突变法(arms法)、taqman荧光探针法等。其中，直接测序法和芯片法虽然一次可对多基因多位点进行检测，但是操作繁琐，检测周期长，成本相对较高，不利于临床推广。限制性片段长度多肽法需要对扩增产物进行凝胶电泳，不仅操作繁琐，而且非封闭管理操作容易引起污染造成假阳性。arms法和taqman荧光探针法相结合，操作简便，灵敏度高，但是对单碱基突变，尤其是高gc含量基因中的单碱基突变的特异性较差，会导致非特异扩增，可能产生假阳性结果。因此，急需开发一种操作简单、特异性好、检测准确性高的人类静脉血栓风险基因多态性检测方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种静脉血栓风险基因多态性检测引物探针组及其检测试剂盒，可以有效解决上述问题。

2、一种静脉血栓风险基因多态性检测引物探针组，包括以下用于荧光pcr熔解的引物和探针；

3、所述引物包括：

4、用于扩增pai-1 4g/5g位点的上游引物序列pai-1-f，序列如seq id no:1所示；用于扩增pai-1 4g/5g位点的下游引物序列pai-1-r，序列如seq id no:2所示；

5、用于扩增proc(565c>t)位点的上游引物序列proc(565c>t)-f，序列如seq id no:3所示；用于扩增proc(565c>t)位点的下游引物序列proc(565

6、c>t)-r，序列如seq id no:4所示；

7、用于扩增proc(574-576delaag)位点的上游引物序列proc-f，序列如seq id no:5所示；用于扩增proc(574-576delaag)位点的下游引物序列proc-r，序列如seq id no:6所示；

8、用于扩增thbd(-151g>t)位点的上游引物序列thbd(-151g>t)-f，序列如seq idno:7所示；用于扩增thbd(-151g>t)位点的下游引物序列thbd(-151g>t)-r，序列如seq idno:8所示；

9、所述探针包括：

10、用于检测pai-1 4g/5g位点的探针序列pai-1-p，序列如seq id no:9所示；

11、用于检测proc(565c>t)位点的探针序列proc(565c>t)-p，序列如seq id no:10所示；

12、用于检测proc(574-576delaag)位点的探针序列proc-p，序列如seq id no:11所示；

13、用于检测thbd(-151g>t)位点的探针序列thbd(-151g>t)p，序列如seq id no:12所示。

14、一种上述引物探针组在制备静脉血栓风险基因多态性检测试剂中的应用。

15、一种静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒，包括所述的引物探针组及用于荧光pcr熔解的试剂。

16、作为进一步改进的，所述的静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒还包括阳性质控、复溶溶剂及空白对照。

17、作为进一步改进的，所述阳性质控包括pai-1-4g阳性质粒、pai-1-5g阳性质粒、proc(565c>t)-c阳性质粒、proc(565c>t)-t阳性质粒、proc-del阳性质粒、proc-dup阳性质粒、thbd(-151g>t)-g阳性质粒及thbd(-151g>t)-t阳性质粒。

18、作为进一步改进的，所述的引物探针组和所述用于荧光pcr熔解的试剂混合后制为冻干制剂。

19、作为进一步改进的，所述阳性质控为冻干制剂。

20、作为进一步改进的，所述用于荧光pcr熔解的试剂包括纯化水、tris-hcl、kcl、tween-20、mgcl2、datp、dgtp、dctp、dttp、dutp、taq酶、bsa溶液、甘露醇溶液及海藻糖溶液。

21、一种上述的静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒的应用方法，包括以下步骤：取样，应用所述试剂盒进行荧光pcr熔解检测，根据所采集的荧光信号进行结果判定。该方法不仅应用于疾病诊断，还可应用于实验研究。

22、作为进一步改进的，所述荧光pcr熔解检测的荧光pcr扩增程序为：预变性：95℃，2min，1个循环；降落循环程序为：95℃，10s，68℃，15s，72℃，15s，8个循环；pcr循环程序为：95℃，10s，60℃，15s，72℃，15s，35个循环；

23、所述荧光pcr熔解检测的熔解曲线分析程序为：95℃，1min，37℃～85℃，设置采集famhex/rox/cy5通道荧光信号，slan-96p熔解速率0.06℃/s，1个循环。

24、本发明的有益效果是：

25、本发明的静脉血栓风险基因多态性检测引物探针组，应用于荧光pcr熔解技术进行基因多态性检测，操作简单，特异性和准确性高。

26、一种上述的静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒应用于基因多态性检测，可以一管搞定检测，保证检测通量、操作便捷。