替尔泊肽的制备方法与流程

本发明属于多肽合成，具体涉及替尔泊肽的制备方法。

背景技术：

1、临床研究显示，替尔泊肽在显著改善2型糖尿病患者的血糖水平时，还能够降低患者体重。6个月数据显示，替尔泊肽能将2型糖尿病hba1c水平平均降低2.4％，体重减重11.3kg（12.7％）。替尔泊肽在保持疗效的同时，降低了患者胃肠道不良事件发生率。具体数据为hba1c水平降低2％，体重减轻5.7kg。双效gip和glp-1受体激动剂替尔泊肽（ly3298176）随机、平行、开放标签、52周iii期surpass-4（nct03730662）临床试验的顶线结果数据显示，在心血管（cv）风险升高的2型糖尿病成人患者中，与滴定甘精胰岛素相比，全部3种剂量替尔泊肽在降低血糖和体重方面均显示出优越性：治疗52周，采用疗效估量统计学分析方法，最高剂量替尔泊肽（15mg，每周1次）将血糖水平从基线降低2.58％、将体重从基线降低11.7公斤（25.8磅，13.0％），而滴定甘精胰岛素将血糖水平从基线降低1.44％、体重较基线增加1.9公斤（4.2磅，2.2％）。在这一患者群体中，替尔泊肽的总体安全性与胰高血糖素样肽-1受体激动剂类别一致。胃肠道副作用是最常见的不良反应，通常发生在剂量递增期，然后随着时间的推移而减少。替尔泊肽除对2型糖尿病和肥胖症疗效显著外，对非酒精性脂肪性肝炎也显示出一定的治疗潜力。

2、替尔泊肽的制备方法的研究有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可用于替尔泊肽制备、收率高、纯度佳的制备方法。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、替尔泊肽的制备方法，包括：将替尔泊肽线性肽、替尔泊肽衍生侧链中间体和功能剂混合于溶剂中，然后经反应制备得到替尔泊肽；替尔泊肽衍生侧链中间体具有替尔泊肽衍生侧链及与其键合的活性试剂；

4、替尔泊肽线性肽的肽链如下所示：

5、dde-tyr-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-ile-aib-leu-asp-lys(dde)-ile-ala-gln-lys-ala-phe-val-gln-trp-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2；

6、替尔泊肽衍生侧链的链序如下：

7、otbu-ico-glu(aeea-aeea-oh)-otbu。本发明通过氨基酸试剂首先制备得到替尔泊肽线性肽，然后制备替尔泊肽衍生侧链，由替尔泊肽衍生侧链与活性试剂反应制备得到替尔泊肽衍生侧链中间体，在由替尔泊肽线性肽与替尔泊肽衍生侧链中间体进行反应制备替尔泊肽时，发现在功能剂作用下，可以提高替尔泊肽的收率和纯度。

8、优选地，溶剂为dcm、thf、乙酸乙酯、乙腈、dmf、dmso、nmp、水、丙酮、二甲基乙酰胺dmac和六甲基磷酰胺hmp中至少1种；或，溶剂为dmf、dmso、dmac、hmp、乙腈-水和丙酮-水中至少1种。

9、优选地，功能剂包括有机碱、无机碱和咪唑盐中至少1种，咪唑盐由n-甲基咪唑与1-氯-4-甲氧基丁烷反应制成；有机碱包括三乙胺（tea）、二乙胺、n-甲基吗啉（nmm）和n,n-二异丙基乙胺（diea）中至少1种；无机碱包括醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾和氢氧化钠中至少1种。本发明中的功能剂可选自上述成分，其中，咪唑盐同样可以提高替尔泊肽的收率和纯度；本发明中替尔泊肽衍生侧链中间体包括苯并三氮唑基侧链活性物和吲哚基侧链活性物，咪唑盐中含有甲基基团及4-甲氧基丁烷基基团，在甲基基团和4-甲氧基丁烷基基团及咪唑结构的作用下，提高替尔泊肽的收率和纯度，通过实验探索，发现咪唑盐与含有吲哚基团的吲哚基侧链活性物的联合使用，具优于咪唑盐与苯并三氮唑基侧链活性物的联合使用的效果。

10、优选地，有机碱包括三乙胺（tea）、n-甲基吗啉（nmm）和n,n-二异丙基乙胺（diea）中至少1种；无机碱包括碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾和氢氧化钠中至少1种。

11、优选地，替尔泊肽的制备中，反应温度为-20至60℃；或，替尔泊肽的制备中，反应温度为0至40℃。

12、优选地，替尔泊肽衍生侧链中间体的使用量为替尔泊肽线性肽的20-40wt%；或，功能剂的使用量为替尔泊肽线性肽的5-20wt%。

13、优选地，功能剂为咪唑盐和n-氨基甲酰马来酸；咪唑盐由n-甲基咪唑与1-氯-4-甲氧基丁烷反应制成。本发明中，将咪唑盐和n-氨基甲酰马来酸结合使用后，在包括苯并三氮唑基侧链活性物或吲哚基侧链活性物的替尔泊肽衍生侧链中间体制备替尔泊肽的方法中，可以提高替尔泊肽的收率和纯度。

14、更优选地，n-氨基甲酰马来酸的使用量为替尔泊肽线性肽的2-6wt%。

15、优选地，替尔泊肽衍生侧链中间体包括苯并三氮唑基侧链活性物和吲哚基侧链活性物中至少1种，苯并三氮唑基侧链活性物由替尔泊肽衍生侧链与苯并三氮唑键合形成，吲哚基侧链活性物由替尔泊肽衍生侧链与吲哚键合形成；或，活性试剂为苯并三氮唑或吲哚。

16、本发明公开了包括咪唑盐的功能剂在制备替尔泊肽中的用途，咪唑盐由n-甲基咪唑与1-氯-4-甲氧基丁烷反应制成。

17、优选地，功能剂还包括n-氨基甲酰马来酸。

18、优选地，替尔泊肽线性肽的肽链如下所示：

19、dde-tyr-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-ile-aib-leu-asp-lys(dde)-ile-ala-gln-lys-ala-phe-val-gln-trp-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2。

20、优选地，fmoc-linker试剂活化液的配制中，将fmoc-linker和hobt加入dmf中，在0-10℃下加入dic静置活化10-30min，得到fmoc-linker试剂活化液。

21、更优选地，fmoc-linker试剂活化液的配制中，fmoc-linker加入dmf中时，fmoc-linker与dmf的用量关系为0.3-1.2mmol/ml，hobt的使用摩尔量与fmoc-linker的使用摩尔量相同，dic的使用摩尔量与fmoc-linker的使用摩尔量相同。

22、优选地，氨基酸试剂活化液的配制中，将氨基酸试剂和hobt加入dmf中，在0-10℃下加入dic静置活化10-30min，得到氨基酸试剂活化液。

23、更优选地，氨基酸试剂活化液的配制中，氨基酸试剂加入dmf中时，氨基酸试剂与dmf的用量关系为0.3-1.2mmol /ml，hobt的使用摩尔量与氨基酸试剂的使用摩尔量相同，dic的使用摩尔量与氨基酸试剂的使用摩尔量相同。

24、更优选地，氨基酸试剂活化液的配制中，氨基酸试剂包括：fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-(hmb)gly-oh、fmoc-gly-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-aib-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、dde-tyr(tbu)-oh。

25、优选地，替尔泊肽线性肽树脂的制备中，将fmoc-linker试剂活化液加入含有amresin的反应器中，搅拌反应1-3h，反应完成后，进行后处理，然后按替尔泊肽主链的肽序依次加入氨基酸试剂活化液进行反应10-30min，每次加入氨基酸试剂活化液进行反应之后，均先进行后处理，然后再加入新的氨基酸试剂活化液，当最后一种氨基酸试剂反应完后，经洗涤处理，得到替尔泊肽线性肽树脂。

26、更优选地，替尔泊肽线性肽树脂的制备中，am resin的使用量为fmoc-linker试剂活化液的10-30wt%，氨基酸试剂活化液使用量以其中氨基酸试剂的量进行计量，氨基酸试剂的使用摩尔量与fmoc-linker试剂活化液中fmoc-linker试剂的使用摩尔量相同。

27、更优选地，替尔泊肽线性肽树脂的制备中，氨基酸试剂活化液中氨基酸试剂的添加顺序如下：fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-(hmb)gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-gly-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-ile-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-aib-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、fmoc-aib-oh、dde-tyr(tbu)-oh。

28、优选地，脱保护液的配制中，将pip加入dmf中，混合得到脱保护液。

29、更优选地，脱保护液的配制中，脱保护液中pip的含量为10-30wt%。

30、优选地，后处理中，先采用dmf溶液洗涤，然后加入脱保护液在20-40℃下搅拌脱保护20-60min，最后再经dmf溶液洗涤。需要脱保护的产物完全浸没于脱保护液中。

31、优选地，切割液的配制中，将tfa、tis、edt和phoh加入水中，混合得到切割液。

32、更优选地，切割液的配制中，切割液中tfa、tis、edt和phoh的体积比为1：0.02-0.12：0.01-0.06：0.01-0.06：0.01-0.06。

33、优选地，替尔泊肽线性肽的制备中，将替尔泊肽线性肽树脂加入切割液中，在20-40℃下搅拌处理60-240min，过滤，除去树脂，滤液经冰甲叔醚洗涤，离心，得到替尔泊肽线性肽粗品，反向层析柱纯化，得到替尔泊肽线性肽。替尔泊肽线性肽树脂完全浸没于切割液中。

34、优选地，替尔泊肽衍生侧链的链序如下：

35、otbu-ico-glu(aeea-aeea-oh)-otbu。

36、优选地，fmoc-aeea-oh反应液的配制中，将fmoc-aeea-oh加入二氯甲烷中，然后再加入diea，混合均匀，得到fmoc-aeea-oh反应液。

37、更优选地，fmoc-aeea-oh反应液的配制中，fmoc-aeea-oh加入二氯甲烷中时，fmoc-aeea-oh与二氯甲烷的用量关系为0.2-1mmol/ml，diea的使用摩尔量与fmoc-aeea-oh的使用摩尔量相同。

38、优选地，侧链试剂活化液的配制中，将侧链试剂和hobt混合，然后在0-10℃的温度下加入dmf和dic，静置反应5-30min，得到侧链试剂活化液。

39、更优选地，侧链试剂活化液的配制中，侧链试剂加入dmf中时，侧链试剂与dmf的用量关系为0.3-1.2mmol /ml，hobt的使用摩尔量与侧链试剂的使用摩尔量相同，dic的使用摩尔量与侧链试剂的使用摩尔量相同；侧链试剂包括：fmoc-aeea-oh、fmoc-glu-otbu、二十烷二酸单叔丁酯。

40、优选地，替尔泊肽衍生侧链的制备中，将fmoc-aeea-oh反应液加入含有ctc树脂的反应器中，在20-40℃下反应2-6h，反应完成后，加入甲醇反应3-20min，经洗涤处理和脱保护处理，然后按替尔泊肽衍生侧链的链序加入侧链试剂活化液，每次加入侧链试剂活化液进行反应之后，均采用洗涤处理和脱保护处理，然后再加入新的侧链试剂活化液，当最后一种侧链试剂反应完后，经洗涤处理，然后经裂解液处理，得到替尔泊肽衍生侧链。

41、更优选地，替尔泊肽衍生侧链的制备中，ctc树脂的使用量为fmoc-aeea-oh反应液的10-30wt%，甲醇的使用量为ctc树脂的50-200wt%，侧链试剂活化液使用量以其中侧链试剂的量进行计量，侧链试剂的使用摩尔量为fmoc-aeea-oh反应液中fmoc-aeea-oh的使用摩尔量的100-300%，侧链试剂活化液中侧链试剂的添加顺序如下：fmoc-aeea-oh、fmoc-glu-otbu、二十烷二酸单叔丁酯。fmoc-aeea-oh反应液于ctc树脂中反应后，洗涤处理中，依次采用dcm洗涤、甲醇洗涤和dmf洗涤。加入侧链试剂活化液反应后，洗涤处理中，采用dmf洗涤。最后一种侧链试剂反应完后，洗涤处理中，依次采用dmf洗涤、甲醇洗涤、dcm洗涤和甲醇洗涤。脱保护处理中，将脱保护液加入需脱去保护基团的产物中，在20-40℃下搅拌脱保护20-60min。需要脱保护的产物完全浸没于脱保护液中。

42、优选地，苯并三氮唑基侧链活性物的制备中，将替尔泊肽衍生侧链加入dmf中，然后加入苯并三氮唑，在0-5℃的温度下加入edcl，混合后在20-40℃的温度下搅拌反应12-24h，反应完成后，加入ea和水，萃取有机相，有机相蒸干，得到苯并三氮唑基侧链活性物。

43、更优选地，苯并三氮唑基侧链活性物的制备中，替尔泊肽衍生侧链的使用量为dmf的5-20wt%，苯并三氮唑的使用量为替尔泊肽衍生侧链的10-20wt%，edcl的使用量为替尔泊肽衍生侧链的20-30wt%，ea的使用量为dmf的50-150wt%，水的使用量为dmf的150-250wt%。

44、优选地，吲哚基侧链活性物的制备中，将替尔泊肽衍生侧链加入dmf中，然后加入吲哚，在0-5℃的温度下加入edcl，混合后在20-40℃的温度下搅拌反应12-24h，反应完成后，加入ea和水，萃取有机相，有机相蒸干，得到吲哚基侧链活性物。

45、更优选地，吲哚基侧链活性物的制备中，替尔泊肽衍生侧链的使用量为dmf的5-20wt%，吲哚的使用量为替尔泊肽衍生侧链的10-20wt%，edcl的使用量为替尔泊肽衍生侧链的20-30wt%，ea的使用量为dmf的50-150wt%，水的使用量为dmf的150-250wt%。

46、优选地，咪唑盐的制备中，在0-5℃下将n-甲基咪唑与1-氯-4-甲氧基丁烷混合，然后在70-90℃下及搅拌下反应24-72h，反应完成后，冷却至室温，乙酸乙酯洗涤，旋蒸，真空干燥，得到油状液体形式的咪唑盐。

47、更优选地，咪唑盐的制备中，n-甲基咪唑的使用量为1-氯-4-甲氧基丁烷的60-80wt%。

48、优选地，替尔泊肽的制备中，将替尔泊肽线性肽加入dmf中，然后加入咪唑盐和替尔泊肽衍生侧链中间体，搅拌反应1-5h，反应完成后加入大量丙酮，析出沉淀，离心，真空干燥，得到替尔泊肽。

49、更优选地，替尔泊肽的制备中，替尔泊肽线性肽的使用量为dmf的1-3wt%，咪唑盐的使用量为替尔泊肽线性肽的5-20wt%，替尔泊肽衍生侧链中间体的使用量为替尔泊肽线性肽的20-40wt%。丙酮的使用量适量。替尔泊肽衍生侧链中间体为苯并三氮唑基侧链活性物或吲哚基侧链活性物。

50、优选地，替尔泊肽的制备中还可以加入n-氨基甲酰马来酸，n-氨基甲酰马来酸的使用量为替尔泊肽线性肽的2-6wt%。

51、本发明由于采用了将氨基酸试剂配制成氨基酸试剂活化液，然后按替尔泊肽线性肽的肽序于am树脂上进行反应制备得到替尔泊肽线性肽；然后按替尔泊肽衍生侧链的链序于ctc树脂上进行反应制备得到替尔泊肽衍生侧链；将替尔泊肽衍生侧链与活性试剂结合制成替尔泊肽衍生侧链中间体，替尔泊肽衍生侧链中间体包括苯并三氮唑基侧链活性物或吲哚基侧链活性物，苯并三氮唑基侧链活性物由苯并三氮唑与替尔泊肽衍生侧链反应制成，吲哚基侧链活性物由吲哚与替尔泊肽衍生侧链反应制成；本发明还通过n-甲基咪唑与1-氯-4-甲氧基丁烷反应制备得到咪唑盐，然后将咪唑盐应用于替尔泊肽线性肽与替尔泊肽衍生侧链中间体的反应中，制备得到替尔泊肽，因而具有如下有益效果：替尔泊肽的制备收率高，替尔泊肽的制备纯度佳。因此，本发明是一种可用于替尔泊肽制备、收率高、纯度佳的替尔泊肽的制备方法。