一种鼠抗兔IgG异嗜性抗体阻断剂及其制备方法

本发明属于抗受体，细胞表面抗原或细胞表面决定因子，具体涉及一种鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂及其制备方法。

背景技术：

1、以抗原-抗体特异性识别为基础的免疫分析检测是目前广泛应用的检测技术，其检测的特异性，灵敏度和准确性可能会受到不同因素的干扰，从而导致检测的结果特别是准确性受到影响。

2、已知人或动物体内存在多种干扰因子在检测过程中影响检测结果的准确性，干扰病情的把握与治疗，造成重复检测和资源浪费。因此，消除干扰是免疫检测分析中的一项重要的考虑因素，对于检测系统的灵敏度，准确性等重要参数将会产生不同程度的影响。消除检测干扰首先是除去非特异性的干扰，阻断检测组分与体系固相材料的非特异性结合，从而降低背景信号，改善检测的灵敏度和准确性。然而除此之外，来源于待测样本中内源性的干扰因子，如异嗜性抗体，类风湿因子，人抗动物抗体，自身抗体和其他蛋白等，会对待检测抗体的识别特异性和准确性形成干扰，即抗体干扰。

3、阻断剂是能运用于检测试剂盒中使检测结果出现假阳性的概率降低的一种单克隆抗体，阻断剂可以与人或动物体内的干扰因子结合，降低干扰因子对检测结果的影响。

4、本发明利用elisa筛选出阳性较强的细胞，克隆阳性较强的杂交瘤细胞制备细胞株，注射入小鼠使产生腹水，从腹水中高效提取的单克隆抗体可以特异性识别抗体的fab段位点并进行封闭，使干扰抗体无法与待测抗原抗体或试剂中的抗原抗体反应，避免检测结果受到干扰。由于此阻断剂可主动结合大部分干扰因子，因此具有广谱效应，效价高且效果好，适用于各种检测试剂盒可以有效降低检测结果出现假阳假阴的概率。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种广谱性的鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂及其制备方法，该异嗜性抗体阻断剂纯度高、亲和力强，用于各种检测试剂盒中能够使检测结果中假阳性和假阴性出现的概率显著降低。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

3、提供一种鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂，其制备方法具体步骤如下：

4、1)动物免疫：将兔igg抗原按免疫量溶于生理盐水中，加入等体积的佐剂制成乳化剂，免疫balb/c小鼠，免疫后经elisa检测小鼠尾部血清的效价；

5、2)细胞融合：选择经elisa检测效价最高的balb/c小鼠，分离出其脾细胞，并与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；

6、3)杂交瘤细胞的筛选：收集杂交瘤细胞的培养液，用elisa方法对每个细胞培养孔的培养液进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，并对最终筛选出的鼠抗兔igg阳性细胞株分别命名；

7、4)杂交瘤细胞的克隆：对筛选的阳性细胞株进行克隆；

8、5)单克隆抗体(mabs)的大量制备：采用动物体内诱生单克隆抗体的方法，取8～12周龄健康balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml，7-30天内注射步骤4)克隆出的杂交瘤细胞，将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下来，1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用不完全培养液将细胞悬浮，混匀，并将细胞数调至1～2×106/ml，每只预处理的小鼠腹腔注射1ml阳性克隆杂交瘤细胞，小鼠腹部肿胀发紫时(约7～9d)收集腹水，收集的腹水3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，于-20℃冻存；

9、6)单克隆抗体的纯化：将-20℃冻存的含有单克隆抗体的腹水提前一天解冻，第二天采用proteing柱亲和层析纯化，得到鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂。

10、按上述方案，步骤1)检测小鼠尾部血清的效价具体方法为：免疫后的balb/c

11、小鼠，从颈部采血1ml，3000rpm离心5min，收集血清，4℃保存，再使用elisa法测定血清效价：

12、(1)包被抗原：用包被缓冲液将包被原稀释至工作浓度(100～500ng/ml)，加入到酶标板中，每孔100μl，2～8℃放置16～18h，然后弃去孔内的液体并拍干，得到包被好的hbeag包被板；

13、(2)封闭：每孔加封闭液150μl，2～8℃放置16～18h，甩出酶标板中的封闭液，37℃放置2h干燥；

14、(3)配液：浓缩通用洗液用纯水稀释，将含hbeag酶标抗体的酶工作液与小鼠igg混合，得到含不同hbr(异嗜性抗体阻断剂)抗体的hbeag酶标抗体工作液，其中小鼠igg浓度50μg/ml；

15、(4)加样：将包被好的hbeag包被板和nq(萘醌)，pq(质体鲲)，小鼠的假阳样本恢复至室温，然后加样，nq，假阳样本和pq分别横向每行加样30μl/孔，然后按布局分别加入30μl含不同hbr抗体的hbeag酶标抗体工作液，轻轻震荡混匀：

16、(5)温育：加样完成后用封板膜封板，置于37℃恒温箱温育45min；

17、(6)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，晾干；

18、(7)显色：每孔加显色剂50μl，轻轻震荡混匀，置于37℃恒温箱温育10min，室温下显色10min；

19、(8)测定：每孔加入终止液50μl，轻轻震荡混匀，10min内测定结果，酶标仪双波长测定od值(主波长450nm，副波长630nm)。

20、按上述方案，步骤2)细胞融合具体步骤如下：

21、(1)免疫细胞悬液的制备：

22、选择经elisa检测效价最高的balb/c小鼠，摘除眼球放血，并分离血清供检测抗体用，同时将小鼠处死，浸泡于体积浓度为75％酒精中5min，随即放入超净工作台内，无菌条件下取脾脏，研磨脾脏，反复冲洗至脾细胞完全洗出，1000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用dmem培养基再离心洗一次，然后将细胞重悬至10ml dmem培养基中，混匀，取脾细胞悬液，细胞计数后备用；

23、(2)饲养细胞的制备：

24、将空白balb/c小鼠按免疫细胞悬液的制备处理，然后根据细胞计数结果，补加hat培养液，使细胞浓度为2×105个/ml，将所得细胞悬液加入96孔培养板内，每孔0.1ml，然后将培养板置于37℃、含5％co2的培养箱内培养48h；

25、(3)骨髓瘤细胞悬液的制备：

26、融合前一周复苏sp2/0小鼠骨髓瘤细胞于完全dmem培养基中，融合当天，收集细胞，离心弃去上清，沉淀中加入30ml不完全dmem培养基，同上离心洗涤一次，然后将细胞重悬至10ml dmem培养基中，混匀，计数后备用；

27、(4)细胞融合：

28、分别吸取含1×108个脾细胞和2～3×107个骨髓瘤细胞的悬液，加入到一只50ml离心管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀，1000rpm离心5min，将上清尽量弃去，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀呈糊状，一手均匀转动离心管，另一手用1ml吸管吸取质量分数为50％的peg溶液1ml，并沿转动的管壁(尽量接近细胞处)加入，从加入到加完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管，静置30s，再将其吹入离心管内，立即在5min内加完25ml不完全培养基，使peg稀释而失去促融作用，所有操作过程保持在37℃，以1000rpm离心5min，弃去上清，加入10ml hat培养基，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀，将所得细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，然后将培养板置于37℃、含5％co2的培养箱内培养，根据情况每2～3d更换培养液一次，换液时吸去1/2～2/3培养基，加入等量新鲜培养基。所用的培养基应按培养时间不同而有所不同：在融合后7d内用hat培养基，第7～14d改用ht培养基，第14d以后用普通的完全培养基。

29、按上述方案，步骤4)采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化，具体步骤如下：取250个活细胞悬浮于4.6ml培养基中，接种到96孔培养板，每孔0.1ml，共36孔，余下1.0ml，补加4ml培养基，接种此细胞液至其次的36孔，每孔0.1ml，最后剩余细胞悬液1.4ml，补加培养基1.4ml，接种最后的24孔，每孔0.1ml，将培养板置于5％co2、37℃孵箱中培养，适时进行换液及检测，有多孔阳性时，取单克隆孔继续进行再次克隆化，直至所有细胞孔的培养液均为阳性。

30、按上述方案，6)单克隆抗体采用proteing柱亲和层析纯化，具体步骤如下：

31、(a)将含有单克隆抗体的腹水以10000rpm的转速离心30min，用400目的纱布过滤除去杂质，所得滤液中含有所需单克隆抗体与其他杂蛋白；

32、(b)用0.01m ph8.3 tris+0.2m nacl缓冲液平衡protein g亲和层析柱，使柱床的ph值达到7-9，取5ml滤液用2倍体积的0.01m ph8.3 tris+0.2m nacl缓冲液稀释，上样，使目的蛋白被吸附到protein g亲和层析柱上；

33、(c)用0.01m ph8.3 tris+0.2m nacl缓冲液平衡protein g亲和层析柱至无蛋白流出，收集各流出液；

34、(d)解离：用0.1m ph2.7的甘氨酸溶液作为游离的配体专一结合目的蛋白，将蛋白质从protein g亲和层析柱中洗脱出来，利用hd-2核酸蛋白检测仪检测各流出液解离后的蛋白，并根据检测结果收集含有目的蛋白的解离液；

35、(e)清洗柱：缓冲液平衡protein g亲和层析柱至流出液ph值为7-8，使protein g亲和层析柱中不含任何蛋白质；

36、(f)用紫外分光光度计测各流出液中目的蛋白的浓度，确保目的蛋白(抗体)全部流出；

37、(g)通过sds-page凝胶电泳法对protein g亲和层析柱方法提纯所得解离液(含目的蛋白)和各流出试样进行分析，并通过elisa双抗夹心法对所得单克隆抗体定性定量分析。

38、本发明还包括上述鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂的制备方法，具体步骤如下：

39、1)动物免疫：将兔igg抗原按免疫量溶于生理盐水中，加入等体积的佐剂制成乳化剂，免疫balb/c小鼠，免疫后经elisa检测小鼠尾部血清的效价；

40、2)细胞融合：选择经elisa检测效价最高的balb/c小鼠，分离出其脾细胞，并与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；

41、3)杂交瘤细胞的筛选：收集杂交瘤细胞的培养液，用elisa方法对每个细胞培养孔的培养液进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，并对最终筛选出的鼠抗兔igg阳性细胞株分别命名；

42、4)杂交瘤细胞的克隆：对筛选的阳性细胞株进行克隆；

43、5)单克隆抗体的大量制备：采用动物体内诱生单克隆抗体的方法，取8～12周龄健康balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml，7-30天内注射步骤4)克隆出的杂交瘤细胞，将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下来，1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用不完全培养液将细胞悬浮，混匀，并将细胞数调至1～2×106/ml，每只预处理的小鼠腹腔注射1ml阳性克隆杂交瘤细胞，小鼠腹部肿胀发紫时收集腹水，收集的腹水3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，于-20℃冻存；

44、6)单克隆抗体的纯化：将-20℃冻存的含有单克隆抗体的腹水提前一天解冻，第二天采用proteing柱亲和层析纯化，得到鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂。

45、本发明还包括上述鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂在检测鼠抗兔igg抗原试剂盒的应用。

46、以及一种包含上述鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂的试剂盒。

47、本发明的有益效果在于：1、本发明提供的鼠抗兔igg异嗜性抗体阻断剂具有纯度高、活性高、安全无副作用等优点。2、本发明的制备方法步骤简单易操作，分离提纯效率高，成本低，制备过程安全、环保。