一种嵌合抗原、嵌合抗原突变体及其设计方法和提高其可溶性和高滴度表达的方法与流程

本发明属于工业微生物，更具体地，涉及一种嵌合抗原、嵌合抗原突变体及其设计方法和提高其可溶性和高滴度表达的方法。

背景技术：

1、副猪嗜血杆菌(glaesserella parasuis)属于巴氏杆菌科，在断奶猪的上呼吸道内表现出宿主特异性亲和力。现有研究已经鉴定出15种副猪嗜血杆菌血清型(sv)，在我国的分离株中，sv4和sv5为主要流行毒株，其次是sv14、sv13和sv12，目前还存在较多分离的流行毒株不能分型。由于在流行性毒株中存在复杂的血清型和难以识别的血清型，预防和控制副猪嗜血杆菌的感染变得越来越困难。目前已报道预防副猪嗜血杆菌的商业疫苗为副猪嗜血杆菌全菌体灭活疫苗，灭活的流行性毒株因其低保护效力或较差的交叉保护而受到限制，因此需要开发新的保护效力更高的疫苗。作为流行病学控制策略的补充，一系列强大的疫苗，包括亚单位疫苗、dna疫苗、mrna疫苗等，使宿主能够在感染致病菌之前诱导全面持久的保护性抗体。这些疫苗能够有效地激活宿主的体液免疫和细胞免疫从而预防和控制疾病，从而成为疫苗开发的重点。

2、亚单位疫苗可以通过将基因插入质粒或将其整合到蛋白表达菌株的基因组中来成功表达，蛋白表达菌株通常包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母。蛋白抗原的选择、合理设计和重组表达稳定性可以影响针对抗原多样性病原体的疫苗商业化应用。特别是重组抗原在大肠杆菌中过表达时，重组抗原的大规模生产受到蛋白水解、低合成滴度、错误折叠和不溶性包涵体的阻碍。

3、目前关于在大肠杆菌中表达tbpb蛋白及其突变体的报道(rafael frandoloso etal.infection and immunity.83(3)，1030-1038.)通过融合大分子量的麦芽糖结合蛋白标签实现了tbpb蛋白可溶性表达，但是其免疫原性低。tbpa是副猪嗜血杆菌铁摄取过程中的主要膜通道蛋白，重组tbpa蛋白可在动物体内诱导高滴度保护性抗体，可以交叉保护多种副猪嗜血杆菌血清型和较高的存活率(huang et al.clin.vaccine immunol.20(6),912-919.),但是因其难以在大肠杆菌中重组表达(ogunnariwo et al.microbialpathogenesis.23(5),273-284)或者易形成不溶性包涵体限制了此蛋白的大规模生产。基于以上研究，目前文献报道通过抗原杂交的方法可以将tbpa的多个抗原表位与tbpb蛋白支架融合，不仅解决了膜蛋白抗原难以重组表达表达的问题，而且给予单一抗原靶向多个细菌表面蛋白的机会。例如针对鲍曼不动杆菌znud外膜受体的四个loop区域与蛋白支架形成的杂交抗原可以使免疫的小鼠完全免受感染，相比于单一znud或蛋白支架诱导更高滴度的ig抗体(qamsari et al.frontiers in immunology.11，158.)。在另一项研究中fegan等人在淋病奈瑟菌下生殖道定植模型和脑膜炎奈瑟菌侵袭性感染模型中评估使用显示，脑膜炎奈瑟菌tbpa的loop10与来自猪病原体副猪嗜血杆菌的tbpb支架产生的杂交抗原对雌性小鼠的下生殖道中消除淋病奈瑟菌方面与全长tbpa一样有效，并且对脑膜炎奈瑟菌的低剂量侵入性感染具有保护作用(fegan et al.frontiers in immunology.10，247.)。因此需要开发一种免疫原性更高的嵌合抗原或提供亚单位疫苗高可溶性高滴度表达的方法，对于促进副猪嗜血杆菌感染性疾病的防控具有重要的理论意义和实践价值。

技术实现思路

1、为了克服上述技术问题，本发明的目的是提供了一种嵌合抗原，该嵌合抗原免疫原性高且能高可溶性高滴度表达；本发明的另一目的是提供一种嵌合抗原突变体；本发明的又一目的是提供上述嵌合抗原和嵌合抗原突变体的设计方法；本发明再一目的是提供提高上述嵌合抗原和嵌合抗原突变体可溶性和高滴度表达的方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、一种嵌合抗原的设计方法，包括如下步骤：

4、s1.构建转铁蛋白结合蛋白tbpa和猪转铁蛋白ptf的tbpa-ptf蛋白复合物模型，预测tbpa-ptf蛋白复合物结合界面中转铁蛋白结合蛋白tbpa参与相互作用的loop区域；

5、s2.构建tbpa-ptf蛋白复合物的tbpa-ptf-membrane复合物模型，通过动力学模拟分析步骤s1所述loop区域，筛选出结合紧密的loop区域；

6、s3.将步骤s2筛选出的loop区域嫁接至转铁蛋白结合蛋白tbpb的c-lobe区域相应替换区域，构建形成嵌合抗原tbpab01。

7、本发明针对副猪嗜血杆菌设计了一种嵌合抗原tbpab01，该方法通过构建转铁蛋白结合蛋白tbpa和猪转铁蛋白ptf的模型，先预测loop区域，然后通过构建磷脂模型，动力学分析筛选出结合紧密的loop区域，并将loop区域嫁接到转铁蛋白结合蛋白tbpb，从而制备得到一种以转铁蛋白结合蛋白tbpb为支架，含有多个线性表位的嵌合抗原tbpab01，本嵌合抗原由于以转铁蛋白结合蛋白tbpb为支架且含有多个线性表位，因此免疫原性高。

8、进一步地，步骤s2所述筛选出结合紧密的loop区域为loop 5、loop 8、plug loop和helix_finger，所述loop区域的氨基酸序列如seq id no.5-8所示，步骤s3所述转铁蛋白结合蛋白tbpb的c-lobe区域相应替换区域的氨基酸序列分别如seq id no.9-12所示。

9、本发明提供了上述设计方法设计得到的嵌合抗原tbpab01。

10、本发明提供了一种嵌合抗原tbpab01，所述嵌合抗原tbpab01的氨基酸序列如seqidno.1所示。

11、本发明提供了一种嵌合抗原突变体的设计方法，利用上述步骤s3中所得嵌合抗原tbpab01，构建tbpab01 n-lobe和猪转铁蛋白ptf的tbpab01-ptf蛋白复合物模型，使用丙氨酸扫描分析tbpab01-ptf蛋白复合物的结合界面中丙氨酸的突变结果，选择δδg变化最大的残基作为突变位点，构建得到嵌合抗原tbpab01突变体。

12、利用上述方法设计突变体的目的是为了对嵌合抗原进行优化，减少其在体内免疫过程中猪转铁蛋白ptf对抗原表位暴露的干扰。

13、本发明提供了上述设计方法设计得到的嵌合抗原tbpab01突变体。

14、本发明提供了一种嵌合抗原tbpab01突变体，所述嵌合抗原tbpab01突变体为以seq id no.1所示的氨基酸序列为亲本，对其第130、144、150、167、194、213或252位氨基酸中的任意一个或几个氨基酸位点进行突变得到。

15、进一步地，所述突变为将seq id no.1所示的氨基酸序列的第130位甘氨酸、或将第144位甘氨酸、或将第150位甘氨酸、或将第167位甘氨酸、或将第194位甘氨酸、或将第213位苯丙氨酸、或将第252位甘氨酸突变为苏氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸中的任意一种。

16、本发明提供了上述嵌合抗原tbpab01或上述嵌合抗原tbpab01突变体的编码基因。

17、进一步地，所述嵌合抗原tbpab01的编码基因的核苷酸序列如seq id no.13所示。

18、本发明提供了重组有上述编码基因的表达载体。

19、进一步地，所述表达载体为pet28a。

20、本发明提供了表达上述嵌合抗原tbpab01或上述嵌合抗原tbpab01突变体的重组菌株。

21、进一步地，所述的重组菌株为大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌。

22、进一步地，所述重组菌株为大肠杆菌，所述大肠杆菌选自大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌jm109、大肠杆菌dh5α或大肠杆菌rosetta。

23、进一步地，所述重组大肠杆菌中嵌合抗原tbpab01是以t7启动子启动表达。

24、本发明提供了一种提高上述嵌合抗原tbpab01或上述嵌合抗原tbpab01突变体可溶性和高滴度表达的方法，所述方法为将助溶标签基因与嵌合抗原tbpab01或嵌合抗原tbpab01突变体的编码基因在重组菌株中融合表达。

25、进一步地，所述助溶标签基因和嵌合抗原的编码基因融合得到的基因为p17-tbpab01，a18-tbpab01或elk16-tbpab01。

26、进一步地，所述融合得到的基因的核苷酸序列如seq id no.30-32所示。

27、进一步地，在重组菌株中融合表达前，还需共表达分子伴侣，所述分子伴侣为groel/groes、skp、clpb或dnakje。

28、进一步地，所述分子伴侣其表达载体的核苷酸序列如seq id no.26-29所示。

29、优选地，所述分子伴侣为groel/groes。

30、本发明提供了重组有上述助溶标签基因与嵌合抗原tbpab01或嵌合抗原tbpab01突变体的编码基因的表达载体。

31、优选地，所述表达载体为pet28a。

32、本发明提供了表达上述助溶标签基因与嵌合抗原tbpab01或嵌合抗原tbpab01突变体的重组菌株。

33、本发明提供了表达上述助溶标签基因与嵌合抗原tbpab01或嵌合抗原tbpab01突变体和分子伴侣groel/groes共表达的重组菌株。

34、进一步地，所述的重组菌株为大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌。

35、进一步地，所述重组菌株为大肠杆菌，所述大肠杆菌选自大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌jm109、大肠杆菌dh5α或大肠杆菌rosetta。

36、进一步地，所述的重组大肠杆菌中嵌合抗原tbpab01是以t7启动子启动表达。

37、本发明提供了一种生产嵌合抗原tbpab01的方法，所述方法为将上述的重组菌株接种至培养基中培养，并添加iptg诱导嵌合抗原tbpab01表达。

38、进一步地，所述培养为低密度分批发酵。

39、进一步地，所述低密度分批发酵为将上述重组菌株添加至发酵罐中，所述发酵罐中l-阿拉伯糖终浓度为0.01m，iptg加入培养基后的终浓度为0.5mm，所述诱导的时间为4h以上，所述iptg诱导其诱导温度为25℃。

40、优选地，所述诱导的时间为10h。

41、优选地，所述发酵罐为5l发酵罐。

42、进一步地，所述培养为高密度补料-分批发酵培养。

43、进一步地，所述高密度补料-分批发酵培养为将上述重组菌株添加至发酵罐中，所述发酵罐中l-阿拉伯糖终浓度为0.02m，iptg加入培养基后的终浓度为0.5mm，所述诱导的时间为6h以上，所述iptg诱导其诱导温度为25℃。

44、优选地，所述诱导时间为34h。

45、优选地，所述发酵罐为5l发酵罐。

46、进一步地，所述培养基为：胰蛋白胨15-40g/l；nacl 0.5-1g/l；酵母粉3-10g/l；kcl 0.15-0.25g/l，葡萄糖15-30g/l；mgcl2 0.8-1.2g/l；微量盐溶液0.2％(v/v)，初始ph值6.8～7.4。

47、本发明的有益效果是：

48、(1)本发明针对副猪嗜血杆菌设计了一种嵌合抗原tbpab01，该方法通过构建转铁蛋白结合蛋白tbpa和猪转铁蛋白ptf的模型，先预测loop区域，然后通过构建磷脂模型，动力学分析筛选出结合紧密的loop区域，并将loop区域嫁接到转铁蛋白结合蛋白tbpb，从而制备得到一种以转铁蛋白结合蛋白tbpb为支架，含有多个线性表位的高免疫原性的嵌合抗原tbpab01。

49、(2)本发明针对上述嵌合抗原tbpab01通过蛋白质工程改造，伴侣蛋白过表达，培养基优化和高密度发酵实现了嵌合抗原tbpab01在重组菌株中的高可溶高滴度表达。

50、(3)本发明的重组菌株e.coli bl21(de3)/pet28a-p17-tbpab01/pbad-groel-groes成功实现tbpab01高可溶性高滴度表达。该菌株在25℃条件下加入终浓度为0.5mmiptg诱导培养10h，摇瓶水平表达量为0.346g/l，进一步在5l发酵罐中扩大培养，在25℃条件下加入终浓度为0.5mm iptg诱导培养34h，tbpab01最高可溶性蛋白滴度为5.16g/l，为目前文献报道最高水平。