一种抗香蕉枯萎病大环内酰胺化合物的制备及其应用

本发明涉及一种香蕉枯萎病的防治，尤其涉及一种抗香蕉枯萎病大环内酰胺化合物的制备及其应用。

背景技术：

1、香蕉（ musa spp.）是世界上产量和贸易量最大的水果（faostat，2021年），也是热区国家的主要口粮，被世界粮农组织定位为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物（qiet al., 2021）。当前，具有经济价值的香蕉栽培品种多采用无性繁殖，狭窄的遗传背景致使其受多种病害的威胁，尤其是香蕉枯萎病，严重制约了香蕉产业的发展（liu et al.,2020）。香蕉枯萎病又称巴拿马病，是一种毁灭性土传性病害，也是世界范围内最严重的真菌病害之一，其由尖孢镰刀菌古巴专化型病原菌（ fusarium oxysporum f. sp.  cubense， foc）引起，可产生真菌毒素，并破坏香蕉维管束，最终导致植株死亡（zhang et al.,2021）。香蕉枯萎病菌有4个生理小种（ foc tr1、 foc tr2、 foc tr3和 foc tr4），其中热带小种 foc tr4危害最大，可感染全球80%以上的香蕉和大蕉品种（aguayo et al., 2020），被认为是全球农业历史上最具破坏性的病害之一。该病原菌会以厚垣孢子形式在土壤中存活几十年，传播途径广，蔓延速度快，目前在我国台湾、福建、海南、广东、广西和云南等香蕉主产区均已发现，其发病率一般在10%~40%之间，严重时甚至造成蕉园绝收，给蕉农带来巨大损失。常规物理和化学措施难以对其进行有效防治，而统合成的抗真菌化学药剂具有毒性残留，严重破坏农业生态环境，威胁食品安全和人类健康，已不能满足现代农业发展的需求。因此，亟需发展高效、安全、绿色的香蕉枯萎病防治方法，服务我国农业的可持续发展。

2、生物防治被认为是香蕉枯萎病最有效且极具潜力的防治措施，挖掘和利用高效拮抗微生物及其活性成分是目前生物防治的主要策略（jing et al., 2020）。微生物产生的活性代谢产物具有高效、广谱、安全等抗真菌特性，其中，链霉菌是产生生物活性次级代谢产物的重要微生物资源（ueno et al., 2016; li et al., 2021）。目前所发现的抗生素中约有 70%~80%是由链霉菌产生的（zou et al., 2021）。利用链霉菌来源的抗菌化合物创制新型农用杀菌剂，在香蕉枯萎病绿色防控中具有潜在的应用前景，也为香蕉枯萎病绿色防控提供了新思路。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，一种抗香蕉枯萎病大环内酰胺化合物的制备及其应用。

2、本发明的第一个方面是提供一种大环内酰胺化合物的制备方法，从萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液中依次经乙醇萃取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、sephadex lh-20凝胶柱层析、rp-hplc分离得到，所述的萨姆松链霉菌xjc-2-6于2017年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc) ，命名为 streptomyces samsunensis xjc-2-6，保藏编号为cctccno: m2017620；所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：

3、。

4、优选地，所述制备方法包括以下步骤：

5、（1）将萨姆松链霉菌xjc-2-6接种到发酵培养液中发酵培养，获得发酵液；

6、（2）向发酵液中加入适量乙醇萃取，过滤后取上清液，加入适量乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相，浓缩得到乙酸乙酯浸膏；

7、（3）采用硅胶柱层析分离乙酸乙酯浸膏，用ch2cl2/meoh体系进行梯度洗脱，ch2cl2/meoh的体积比依次为，100：0，100:1，80:1，60:1，40:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，0：100），将得到的各个组分进行抑菌活性检测（优选采用tlc-bioautography法），靶标病原菌为foc tr4，得活性组分fr. c；

8、（4）将活性组分fr. c经过sephadex lh-20凝胶柱层析，用ch2cl2/meoh洗脱剂进行洗脱，ch2cl2/meoh的体积比为 2:1；将得到的各个组分进行抑菌活性检测（优选采用tlc-direct bioautography法），靶标病原菌为foc tr4，得活性组分fr.c6；

9、（5）将活性组分fr.c6通过rp-hplc反复分离纯化，并经抑菌活性检测，得到高活性单体大环内酰胺化合物。

10、其中，乙醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

11、其中，乙酸乙酯的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

12、进一步优选地，步骤（1）中，所述发酵培养液为fm1液体培养基，接种量为5%，28℃180 r/min振荡培养4d。

13、本发明的第二个方面是提供萨姆松链霉菌xjc-2-6在制备大环内酰胺化合物中的应用。

14、本发明的第三个方面是提供萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液在制备大环内酰胺化合物中的应用。

15、本发明的第四个方面是提供萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液乙酸乙酯提取物在制备大环内酰胺化合物中的应用。

16、其中，所述萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液乙酸乙酯提取物为萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液加入乙醇萃取过滤后的上清液中加入乙酸乙酯萃取浓缩乙酸乙酯相得到的。

17、其中，乙醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

18、其中，乙酸乙酯的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

19、本发明的第五个方面是提供大环内酰胺化合物在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或防治香蕉枯萎病菌4号生理小种所致病害中的应用。

20、本发明的第六个方面是提供大环内酰胺化合物在提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中n-乙酰葡萄糖胺含量、和/或提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中 β-1,3-葡聚糖酶活性、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体生物量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中总糖含量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中蛋白质含量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中脂肪含量中的应用。

21、本发明的第七个方面是提供大环内酰胺化合物在降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中线粒体呼吸链复合体酶i、和/或线粒体呼吸链复合体酶ii、和/或线粒体呼吸链复合体酶iii、和/或线粒体呼吸链复合体酶iv、和/或柠檬酸合酶、和/或异柠檬酸脱氢酶、和/或α-酮戊二酸脱氢酶、和/或琥珀酸脱氢酶、和/或苹果酸脱氢酶、和/或atp合成酶活性中的应用。

22、本发明首次采用萨姆松链霉菌制备上述大环内酰胺化合物，以香蕉枯萎病4号生理小种（foc tr4）为靶标病原菌，对萨姆松链霉菌xjc-2-6进行发酵，萃取获得活性粗提物浸膏，采用正反相硅胶柱层析，sephadex lh-20 凝胶柱层析以及制备hplc等现代色谱分离技术对活性次级代谢产物进行研究，终分离得到了1个抗香蕉枯萎病活性大环内酰胺化合物，进一步研究发现，该化合物能有效拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种，破坏菌丝结构，抑制菌丝生长，ec50为0.084 mm，能够显著提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中n-乙酰葡萄糖胺含量和 β-1,3-葡聚糖酶活性，能够显著降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体生物量以及总糖、蛋白质含量、脂肪含量，同时还能够有效降低线粒体呼吸链复合体酶i～iv、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、atp合成酶等的活性。本发明为制备大环内酰胺化合物提供了新的新的思路，为枯萎病等植物病害的防治拓展新领域，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。