用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合及试剂盒

本发明属于分子生物，具体地说，涉及用于检测牛10种遗传缺陷基因的arms-pcr引物组合及试剂盒。

背景技术：

1、近年来，奶牛的高强度选择，使得重要经济性状取得了显著的遗传进展。然而，育种过程中，仅在少数优秀家系中选择种公牛，导致后代近交程度增加，有害突变积累。科学家们在过去20多年里，在荷斯坦牛中先后发现了多种遗传缺陷基因，包括白细胞黏附缺陷(bovine leukocyte adhesion deficiency，blad；shuster et al.1992)，脊柱畸形综合征(complex vertebral malformation，cvm；agerholm et al.2001)，短脊柱畸形综合征(brachyspina，bs；charlier et al.2012)等。随着基因组检测技术发展，大量基因组数据分析显示，在荷斯坦牛群中存在一些频率较高但是从未纯合的单倍型，一旦纯合就会造成胚胎早期死亡或者初生犊牛死亡，其中包括荷斯坦牛遗传缺陷单倍型hh1、hh2、hh3(holstein haplotype；vanraden et al.,2011)，hh4(fritz et al.,2013)，hh5(cooperet al.,2013)、hh6(fritz et al.,2018)和hcd(haplotype for cholesteroldeficiency；kipp et al.,2015)。

2、上述10种遗传缺陷基因呈现隐性遗传模式，即携带者本身表现正常，但如果携带者公牛和携带者母牛交配，其1/4后代为缺陷基因纯合子，表现为胚胎早期死亡或者初生牛犊死亡。因此，为了实现牛群改良，需要及时检测和发现遗传缺陷携带者，逐步淘汰携带者，同时采用科学手段避免携带者之间的交配。

3、针对致因突变已知的遗传缺陷，基于变异类型特点，可通过多种检测方法在dna水平检测其携带者。目前已报道多种遗传缺陷位点的检测方法，例如，采用pcr-rflp方法检测hh4(fritz et al.,2013；kumar et al.,2020)，利用taqman探针和特异性引物进行实时pcr检测cvm和blad(zhang et al.,2012)，通过pcr产物电泳的方法检测bs(charlier etal.,2012；fang et al.,2013)、hcd(menzi et al.,2016；schütz et al.,2016)和hh5(schütz et al.,2016)。

4、除上述描述的针对单个致因突变位点的检测方法，kasp和arms-pcr方法可实现多位点联合检测方法。虽然两种方法均是基于pcr的基因分型技术，但相较于kasp，arms-pcr方法具备效率高、成本低、操作简便、准确性高等特点，更适用于大规模样本的基因分型检测。因此，利用arms-pcr方法实现一次反应筛选多个遗传缺陷位点，能够准确、快速鉴定出有害突变，为选育更健康的动物提供了可能。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供用于检测牛10种遗传缺陷基因的arms-pcr引物组合及试剂盒。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套用于检测牛10种遗传缺陷基因的arms-pcr引物组合，所述引物组合包括10组，其中，第一组引物如seq id no：1-3所示，用于检测奶牛缺陷单倍型hh1所对应的遗传缺陷基因位点；第二组引物如seq id no:4-6所示，用于检测奶牛缺陷单倍型hh2所对应的遗传缺陷基因位点；第三组引物如seq id no:7-9所示，用于检测奶牛缺陷单倍型hh3所对应的遗传缺陷基因位点；第四组引物如seq idno:10-12所示，用于检测奶牛缺陷单倍型hh4所对应的遗传缺陷基因位点；第五组引物如seq id no：13-15所示，用于检测奶牛缺陷单倍型hh5所对应的遗传缺陷基因位点；第六组引物如seq id no：16-18所示，用于检测奶牛缺陷单倍型hh6所对应的遗传缺陷基因位点；第七组引物如seq id no：19-21所示，用于检测胆固醇缺失症(hcd)所对应的遗传缺陷基因位点；第八组引物如seq id no：22-24所示，用于检测奶牛白细胞粘附缺陷(blad)所对应的遗传缺陷基因位点；第九组引物如seq id no：25-27所示，用于检测奶牛脊柱畸形综合征(cvm)所对应的遗传缺陷基因位点；第十组引物如seq id no：28-30所示，用于检测奶牛短脊柱畸形综合征(bs)所对应的遗传缺陷基因位点。

3、第二方面，本发明提供含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒。

4、第三方面，本发明提供一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的试剂盒，所述试剂盒包含所述引物组合、dntps、mg2+、dna聚合酶和反应缓冲液等。

5、进一步地，所述引物组合中各组引物的浓度为0.15μm-0.4μm。

6、优选地，所述引物组合中第六组、第七组和第十组引物的浓度为0.15μm，第二组引物的浓度为0.18μm，第三组引物的浓度为0.2μm，第九组引物的浓度为0.24μm，第一组和第五组引物的浓度为0.3μm，第八组引物的浓度为0.36μm，第四组引物的浓度为0.4μm。

7、第四方面，本发明提供一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的方法，包括以下步骤：

8、(1)牛血液基因组dna提取；

9、(2)以提取的dna为模板，利用seq id no:1-30所示引物进行pcr扩增反应；

10、(3)对扩增产物进行毛细管电泳检测。

11、配制反应体系：将各反应试剂(2×pcr mix、引物混合液、无核酸酶纯水)震荡混合后按照体积比(dna模板除外)配置pcr反应混合液，分装9μl于pcr反应管中，最后向各反应管加入1μl模板，离心后进行下一步。反应体系组成如下：

12、

13、其中，pcr mix的主要组成如下：dna聚合酶、pcr buffer、dntps、mg2+。

14、引物混合液中各组引物的浓度范围为0.15μm-0.4μm，其中hh6、hcd和bs引物终浓度为0.15μm，hh2引物终浓度为0.18μm，hh3引物终浓度为0.2μm，cvm引物终浓度为0.24μm，hh1和hh5引物终浓度为0.3μm，blad引物终浓度为0.36μm，hh4引物终浓度为0.4μm。

15、pcr反应程序：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火及延伸1分钟，30个循环；60℃延伸30分钟，最后4℃保存。

16、毛细管电泳检测方法如下：取1μl扩增产物(原液或稀释后的产物)，加入8.8μlhidi(高度去离子甲酰胺，abi公司)及0.2μl liz500分子量内标(abi公司)，混合静置数分钟，95℃变性3分钟，立即冰浴3分钟，离心后放入abi3730测序仪中，准备检测。

17、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

18、(一)本发明通过优化引物序列，在arms引物序列中引入错配碱基，提高引物的特异性，使检测结果准确可靠。

19、(二)反复优化多重pcr体系，通过调整优化各位点pcr引物的浓度，优化pcr扩增程序，使10个位点可以在同一个体系中同时完成pcr扩增，大幅提高了检测效率，操作方法简单，检测耗时短。

20、(三)优化设计各位点的pcr产物长度，借助不同的荧光和pcr产物长度，使10个位点通过单次毛细管电泳即可区分基因型，实现了高效检测。

21、(四)检测灵敏度高，低至2ng的dna模板量可以得到准确分型。