一种去gDNA的组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物，涉及用于逆转录前rna样本处理以去除rna中的gdna的污染的组合物。

背景技术：

1、由于rna体外不稳定的特性，对于rna的研究往往需要通过逆转录将rna逆转录成为cdna，因此逆转录是rna研究的最常见的分子生物学技术之一。但受到现有技术限制，磁珠法、过柱法或提取法提取的rna都存在无法完全避免基因组dna的残留的问题，残留的dna进入下游实验可能导致实验结果误读，在一些场景中，例如qpcr，可通过定向设计跨越内含子的引物来避免基因组dna对于实验结果的影响，但此类方式容易受到基因结构、物种的构成的影响(原核生物基因组不存在真核生物中的内含子结构，一些基因也不存在内含子结构)。为了解决这个问题，人们需要对提取的rna去除gdna的污染，如通过dna酶消化后进行rna的再次纯化或化学沉淀法分离rna与dna。

2、随着技术的发展，一些逆转录试剂中匹配dna去除模块，因此，不需要对提取的rna进行额外处理，大大简化了实验流程。逆转录试剂中匹配的dna去除模块往往以各类dna酶为主要工作蛋白，匹配以适当的缓冲，以达成逆转录前去除rna样本中dna的目的。dnase酶活去除方式与dnase自身的特性直接相关。例如，去基因组模块中选用的为热敏感dnase，则后续减酶活方法可通过提高rt反应温度来实现；去基因组模块中选择的为盐敏感dnase，则后续主要通过rt模块中较高的离子浓度来进行dnase活性的减弱。

3、尽管有多重方法在rt反应进行时减低dnase的活性，但受限于失活强度，实际中，dnase用量都无法达到一个较高的程度，一般低于20u/反应。因此，在实际使用中，如果无法保证充足的反应时间，dnase切割后的底物可能仍有较大的概率成为下游dna聚合酶的模板。因此，在计算清除效率的时候，无法达到100％。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种去除rna中gdna污染的组合物，具体涉及切割双链dna的酶和具有dna缺口处切割能力的酶的组合物。

2、本发明提供给一种酶组合物，包含切割双链dna的酶和核酸外切酶或切割双链dna的酶和核酸内切酶。在一些实施方案中，切割双链dna的酶选自dnase i、dsdnase。

3、在一些实施方案中，所述核酸外切酶选自t7核酸外切酶、t5核酸外切酶、核酸外切酶iii、核酸外切酶viii、核酸外切酶i、核酸外切酶vii。在一些实施方案中，所述核酸内切酶选自t7内切酶i、核酸内切酶viii、核酸内切酶v、核酸内切酶iv、核酸内切酶iii，优选t7内切酶i。

4、本发明的第二个目的在于提供一种反应液，利用该反应液去除rna中gdna，改善了去基因组模块的清除效果。

5、本发明提供了一种反应液，包括第一目的所述的酶组合物和缓冲液。

6、在一些实施方案中，所述酶组合物包含切割双链dna的酶和核酸外切酶。在一些实施方案中，所述切割双链dna的酶选自dnase i或dsdnase，所述核酸外切酶选自t7核酸外切酶、t5核酸外切酶、核酸外切酶iii、核酸外切酶viii、核酸外切酶i、核酸外切酶vii。在一些实施方案中，所述酶组合物包含切割双链dna的酶和核酸内切酶。所述核酸内切酶选自t7内切酶i、核酸内切酶viii、核酸内切酶iv、核酸内切酶v或核酸内切酶iii，优选t7内切酶i。

7、在一些实施方案中，所述dnase i在去gdna的反应体系浓度是1-20u/μl，优选1-15u/μl，优选1-10u/μl，更优选1-5u/μl，具体可选自1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl、6u/μl、7u/μl、8/μl、9u/μl、10u/μl、11u/μl、12u/μl、13u/μl、14u/μl、15/μl、16u/μl、17u/μl、18/μl、19u/μl和20u/μl。

8、在一些实施方案中，所述dsdnase在去gdna的反应体系浓度是1-20u/μl，优选1-15u/μl，优选1-10u/μl，更优选5-8u/μl，具体可选自1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl、6u/μl、7u/μl、8/μl、9u/μl、10u/μl、11u/μl、12u/μl、13u/μl、14u/μl、15/μl、16u/μl、17u/μl、18/μl、19u/μl和20u/μl。

9、在一些实施方案中，核酸内切酶viii在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

10、在一些实施方案中，所述t7内切酶i在去gdna的反应体系浓度是0.1-20u/μl，优选0.1-10u/μl，更优选0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl、6u/μl、7u/μl、8/μl、9u/μl、10u/μl、11u/μl、12u/μl、13u/μl、14u/μl、15/μl、16u/μl、17u/μl、18/μl、19u/μl和20u/μl。

11、在一些实施方案中，t7核酸外切酶在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

12、在一些实施方案中，t5核酸外切酶在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

13、在一些实施方案中，核酸外切酶iii在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

14、在一些实施方案中，核酸外切酶viii在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

15、在一些实施方案中，所述反应液还包括缓冲液，所述缓冲物质包括tris、tris-hcl、tris碱或hepes中的一种或多种，优选tris-hcl。在一些实施方案中，所述tris-hcl在去gdna的反应体系中的浓度是20-100mmol/l，具体可选自20mmol/l、25mmol/l、30mmol/l、35mmol/l、40mmol/l、45mmol/l、50mmol/l、55mmol/l、60mmol/l、65mmol/l、70mmol/l、75mmol/l、80mmol/l、85mmol/l、90mmol/l、95mmol/l或100mmol/l。

16、在一些实施方案中，所述缓冲液还包括金属盐，所述金属盐是mg2+盐、k+盐、mn2+盐、na+盐和ca2+盐中的一种或多种。在一些实施方案中，所述金属盐在去gdna的反应体系中的浓度是1-20mmol/l，具体可选自1mmol/l、2mmol/l、4mmol/l、6mmol/l、8mmol/l、10mmol/l、12mmol/l、14mmol/l、16mmol/l、18mmol/l或20mmol/l。

17、在一些实施方案中，所述缓冲液中包括金属盐mg2+盐和ca2+盐；优选地，所述金属盐包括mgcl2和cacl2。在一些实施方案中，所述mgcl2在去gdna反应体系中的浓度是2-20mmol/l，具体可选自2mmol/l、4mmol/l、6mmol/l、8mmol/l、10mmol/l、12mmol/l、14mmol/l、16mmol/l、18mmol/l或20mmol/l，所述cacl2在去gdna反应体系中的浓度是1-10mmol/l，具体可选自1mmol/l、2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l、7mmol/l、8mmol/l、9mmol/l或10mmol/l。

18、在一些实施方案中，所述缓冲液还包括甘油，所述甘油在去基因组dna反应体系中的浓度是10-40％(v/v)，具体可选自10％(v/v)、15％(v/v)、20％(v/v)、25％(v/v)、30％(v/v)、35％(v/v)或40％(v/v)。

19、本发明的第三个目的是提供一种去除逆转录和扩增反应中核酸污染的方法，利用该方法改善了去基因组模块的清除效果，并且不会影响下游逆转录过程cdna的产率和完整度。

20、本发明提供了一种去除逆转录和扩增反应中核酸污染的方法，所述方法包括(1)提供rna样本，(2)用切割双链dna的酶和核酸外切酶或切割双链dna的酶和核酸内切酶的组合处理步骤(1)的rna样本以去除gdna，(3)使用步骤(2)的rna样本进行逆转录反应。

21、在一些实施方案中，所述切割双链dna的酶选自dnase i或dsdnase，所述核酸内切酶选自t7内切酶i、核酸内切酶viii、核酸内切酶iv、核酸内切酶v或核酸内切酶iii，所述核酸外切酶选自t7核酸外切酶、t5核酸外切酶、核酸外切酶iii、核酸外切酶viii、核酸外切酶i、核酸外切酶vii。

22、在一些实施方案中，所述rna样本存在dna，例如gdna。

23、在一些实施方案中，所述dnase i在去gdna反应体系中的浓度是1-20u/μl，优选1-15u/μl，进一步优选1-10u/μl，更优选1-5u/μl，具体可选自1u/μl，2u/μl、4u/μl、6u/μl、8/μl、10u/μl、12u/μl、14u/μl、16u/μl、18u/μl或20u/μl。

24、在一些实施方案中，所述dsdnase在去gdna反应体系中的浓度是1-20u/μl，优选1-15u/μl，进一步优选1-10u/μl，更优选5-8u/μl，具体可选自1u/μl、2u/μl、4u/μl、6u/μl、8/μl、10u/μl、12u/μl、14u/μl、16u/μl、18u/μl或20u/μl。

25、在一些实施方案中，所述t7内切酶i在去gdna反应体系中的浓度是0.1-20u/μl，优选0.1-10u/μl，更优选0.1-5u/μl，具体可选自0.1/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、4u/μl、6u/μl、8/μl、10u/μl、12u/μl、14u/μl、16u/μl、18u/μl或20u/μl。

26、在一些实施方案中，核酸内切酶viii在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

27、在一些实施方案中，t7核酸外切酶在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

28、在一些实施方案中，t5核酸外切酶在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

29、在一些实施方案中，核酸外切酶iii在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

30、在一些实施方案中，核酸外切酶viii在去gdna的反应体系浓度是0.1-5u/μl，具体可选自0.1u/μl、0.5/μl、1u/μl、2u/μl、3u/μl、4u/μl、5/μl。

31、在一些实施方案中，所述步骤(2)处理样本的温度是35-50℃，优选40-45℃，更优选是42℃。所述处理样本的时间是1-10min，优选1-5min，更优选2min。

32、在一些实施方案中，所述步骤(3)包括使用逆转录酶、dntp、引物和缓冲物质进行逆转录。在一些实施方案，所述逆转录酶包括但不限于本领域已知的一切具有rna指导的dna聚合酶活性的逆转录酶，如mmlv、hiv或amv，优选mmlv逆转录酶。

33、在一些实施方案中，所述方法还包括qpcr扩增反应，所述qpcr扩增反应包括预变性和循环反应，所述预变性的温度是90-98℃，例如92-96℃，例如95℃温育20s-60s，例如25s-40s，例如30s；所述循环反应包括95℃变性8-12s，在55-65℃退火并延伸10-30s，共35-50个循环，例如40个循环。

34、本发明的第四个目的是提供一种包含切割双链dna的酶和核酸内切酶或切割双链dna的酶和核酸外切酶试剂盒。利用该试剂盒改善了去基因组模块的清除效果，并且此方法不会影响下游逆转录过程cdna的产率和完整度。

35、在一些实施方案中，所述切割双链dna的酶选自dsdnase、dnase i。

36、在一些实施方案中，所述dsdnase包括但不限于天然虾dsdnase、重组虾dsdnase，所述dnase i包括但不限于人dnase i、大鼠dnase i、小鼠dnase i或牛dnase i。

37、在一些实施方案中，所述核酸内切酶选自t7内切酶i、核酸内切酶viii、核酸内切酶iv、核酸内切酶v或核酸内切酶iii，优选t7内切酶i，所述核酸外切酶选自t7核酸外切酶、t5核酸外切酶、核酸外切酶iii、核酸外切酶viii、核酸外切酶i、核酸外切酶vii。

38、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括逆转录酶，所述逆转录酶包括但不限于本领域已知的一切具有rna指导的dna聚合酶活性的逆转录酶，如mmlv、hiv或amv，优选mmlv逆转录酶。

39、本发明的第五个目的是提供一种切割双链dna的酶和核酸内切酶或切割双链dna的酶和核酸外切酶的组合在去除rna中gdna污染的用途。

40、在一些实施方案中，所述切割双链dna的酶选自dsdnase、dnase i。在一些实施方案中，所述核酸内切酶选自t7内切酶i、核酸内切酶viii、核酸内切酶iv、核酸内切酶v或核酸内切酶iii，优选t7内切酶i，所述核酸外切酶选自t7核酸外切酶、t5核酸外切酶、核酸外切酶iii、核酸外切酶viii、核酸外切酶i、核酸外切酶vii。

41、本发明的有益效果

42、相较于只用dnase i的方法，采用本方案，gdna的清除能够达到更高的效率，同时不会对新产生的cdna造成影响。