共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒及其活载体疫苗和应用

本发明涉及动物生物制品和病毒学，特别是涉及一种共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒及其活载体疫苗和应用。

背景技术：

1、猫杯状病毒(fcv)在猫科动物中具有较高的感染性和传播性，会引起口腔溃疡、口腔黏膜感染、鼻结膜炎等症状，除了引起呼吸系统症状的fcv毒株，能够引起患猫跛行、流产、皮肤水肿、皮肤溃烂等全身多系统、器官病变(virulent system disease,vsd)甚至死亡的强毒株fcv-vsd也被相继报道，强毒株感染的猫死亡率在50％～100％。fcv基因组分别编码3个开放阅读框(open reading frame,orfs)，基因组的组成从5＇末端到3＇末端分别是ploya、orf1、orf2，orf3、vpg，orf1位于基因组5＇端，主要编码fcv的非结构蛋白，主要包括病毒复制、增殖必须的蛋白酶。orf2编码的vp1，是fcv的主要衣壳蛋白。vp1作为fcv最重要的结构蛋白，在病毒基因组复制、病毒感染、宿主识别中都发挥重要的作用，vp1可以被宿主的免疫系统识别，诱导动物机体产生中和抗体，是目前fcv疫苗研发、治疗制剂、检测方法建立的重要靶标。

2、猫泛白细胞减少症(feline panleukopenia,fpl)，又称为猫瘟热、猫细小病毒病，是由猫细小病毒(feline parvovirus,fpv)感染引起的，以动物淋巴细胞受损、血液中白细胞数量大量减少为特征的急性、高度接触性传染病。目前fpv在全球范围内皆有流行，对家养宠物、野生动物、经济动物养殖业都有严重危害。fpv基因组主要编码两种结构蛋白vp1和vp2。其中vp2占88～90﹪，而vp1仅占10～12﹪。vp2是fpv主要的结构性蛋白和功能性蛋白，在fpv的感染过程中有识别宿主的重要功能，vp2蛋白含有fpv主要的抗原位点sitea和siteb，大多数识别site b的单克隆抗体都对fpv具有有效的中和活性，vp2是fpv重要的保护性抗原蛋白，也是fpv疫苗、治疗制剂研发的重要靶标。

3、猫传染性鼻气管炎又称为猫鼻支，是由猫疱疹病毒i型(fhv-1)引起的一种以急性上呼吸道症状为特征的高度接触性传染病，具体症状包括：角膜结膜炎、上呼吸道感染和流产，但以打喷嚏、过度流涎、眼鼻分泌物增多等上呼吸道症状为主。本病临床常见于猫，猫的发病率高达100％，病死率在不同年龄段的猫中差异很大，成年猫一般不引起死亡，但幼仔猫的死亡率可达50％。患病动物可终生带毒排毒，且在一定条件刺激下反复感染。

4、目前，国内尚无自主研发的fhv-1、fcv和fpv疫苗，主要依赖于接种进口的“妙三多”防控fhv-1、fcv和fpv，但面临进口难、成本高、免疫效果不佳，不能有效控制当前fhv-1、fcv和fpv的流行等问题。因此，急需开发一款自主研发的疫苗以精准防控fhv-1、fcv和fpv的流行。研究表明，以猫疱疹病毒为载体插入其它病毒免疫原的重组弱毒活疫苗安全性良好，除体液免疫外，能够激起较强的细胞免疫和黏膜免疫，尤其是激活的细胞免疫能够增强机体对外源抗原的免疫反应，因此其免疫保护效果通常优于灭活疫苗。同时，此类重组猫疱疹病毒活载体疫苗属联苗产品，具备一针防多病的优点，可以大大简化免疫程序，进而降低免疫成本及免疫应激反应。

5、目前，大多数研究往往是采用在猫疱疹病毒载体中插入一种抗原基因，如插入猫杯状病毒、猫白血病病毒、猫艾滋病病毒或狂犬病毒的抗原单基因，这些重组病毒因外源抗原免疫原性及插入位点的差异，表现出针对上述疾病不同的免疫保护效果。同时，少有在猫疱疹病毒载体中插入多种抗原基因的研究报道，原因在于，插入多种抗原基因通常需要替换猫疱疹病毒的多个基因，而猫疱疹病毒基因组较大，操纵较为困难。对此，本发明通过crispr cas9介导的同源重组法，快速将免疫原性良好的猫杯状病毒和猫细小病毒的抗原蛋白分别插入到猫疱疹病毒的gi/ge和tk位置，以开发fhv-1、fcv和fpv三联重组猫疱疹病毒活载体疫苗产品。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒及其活载体疫苗和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该活载体疫苗缺失了猫疱疹病毒i型的主要毒力基因tk、gi、ge基因，同时稳定表达猫杯状病毒主要抗原蛋白vp1及猫细小病毒vp2抗原蛋白，该疫苗在免疫动物体内，可以诱导良好的体液免疫与细胞免疫应答，适用于作为猫瘟、猫杯状病毒病和猫传染性鼻气管炎的三联活载体疫苗。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒的构建方法，包括以下步骤：

4、分别获取fcv病毒的vp1基因、fpv病毒的vp2基因以及fhv-1病毒的tk左右侧同源臂tkhm1、tkhm2和gi、ge同源臂gihm1、gehm2，利用同源重组和pcr扩增方法，获得tkhm1-vp2-tkhm2和gihm1-vp1-gehm2片段；

5、依据cmv、polya基因的sgrna引物，利用crispr基因编辑方法构建cmv、polya基因的sgrna表达载体，转染、收取慢病毒、感染crfk细胞，获得crfk稳转细胞系；

6、将tkhm1-vp2-tkhm2和gihm1-vp1-gehm2片段转染至crfk稳转细胞系，得到转染细胞，将转染细胞感染rwh/2020-△tk/gi/ge-egfp+-mcherry+毒株，得到共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒。

7、进一步地，所述tkhm1-vp2-tkhm2片段的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述gihm1-vp1-gehm2片段的核苷酸序列如seq id no：2所示。

8、进一步地，所述sgrna引物的核苷酸序列如seq id no：3-6所示。

9、本发明还提供一种所述构建方法获得的共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒。

10、本发明还提供一种所述的共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒在制备防治猫杯状病毒病的疫苗中的应用。

11、本发明还提供一种所述的共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒在制备防治猫细小病毒病的疫苗中的应用。

12、本发明还提供一种所述的共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒在制备防治猫传染性鼻气管炎的疫苗中的应用。

13、本发明还提供一种同时防治猫杯状病毒、猫细小病毒和猫疱疹病毒的活载体疫苗，所述活载体疫苗包含所述的共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒。

14、进一步地，所述活载体疫苗还包含保护剂。

15、进一步地，将所述共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒接种细胞，收取病毒液，将病毒液与保护剂混合后，冷冻干燥，得到所述活载体疫苗。

16、本发明公开了以下技术效果：

17、本发明构建的重组猫疱疹病毒的活载体疫苗，是以缺失tk、gi和ge基因的猫疱疹病毒为活载体，构建表达猫杯状病毒与猫细小病毒的主要免疫保护性抗原基因的重组活载体疫苗，在免疫动物体内，该重组活载体疫苗能诱导良好的体液免疫与细胞免疫应答，可以弥补常规灭活疫苗不能有效激活细胞免疫的缺陷。本发明获得的活载体疫苗(rwh2020-δtk/gi/ge-vp1-vp2)具有猫疱疹病毒i型弱毒疫苗株的特征，可作为防控猫细小、猫杯状病毒病和猫传染性鼻气管炎三联活载体疫苗，能大大减少猫只免疫次数，降低免疫成本，对提升养猫业经济效益和宠物福利意义重大，具有良好的应用前景。