一种高效羟基化的重组人源III型胶原蛋白α1链的序列的方法与流程

本发明涉及重组人源iii型胶原蛋白及其高效羟基化的改造方法，尤其涉及一种高效羟基化的重组人源iii型胶原蛋白α1链的序列的方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是一种功能性结构蛋白，广泛分布于人和动物结缔组织的细胞外基质(ecm)中，占全身蛋白质总量的30％，是人体内最丰富的蛋白质家族之一。胶原蛋白由3条α-多肽链相互盘绕成右手三螺旋，然后以1/4交错、平行排列方式组装，形成胶原蛋白-胶原纤维的超分子聚集结构。胶原蛋白在维持正常生理功能、修复损伤、影响细胞附着和增殖等多种生物学功能中发挥着不可或缺的作用。所有类型的胶原蛋白都具有三螺旋结构域，其中(gly-x-y)n三肽重复序列是螺旋区域的主要特征。

2、由于胶原蛋白种类繁多，通常将常见的胶原蛋白类型分为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、ⅴ型和ⅺ型等胶原蛋白。其中iii型胶原蛋白在血管、肠道和皮肤中含量丰富，在生物体的生长和伤口愈合过程中发挥重要作用，在伤口愈合过程中，iii型胶原蛋白诱导炎症细胞和成纤维细胞迁移至伤口部位，促进结缔组织形成和恢复。iii型胶原蛋白也是一种天然止血材料，可以诱导血小板粘附和聚集到出血部位，并激活凝血级联反应中的一些凝血因子。在整容手术中iii型胶原蛋白通常用来充当皮肤填充剂，以治疗皱纹和皮肤老化，还可作为烧伤患者的康复辅助工具，也能用于骨骼重建以及各种牙科、整形外科和外科手术以达到人工修复效果。

3、目前市场上的胶原蛋白产品大多是从哺乳动物的组织器官和结缔组织中提取，需要耗费大量原材料这无疑会对动物养殖和环境保护造成巨大影响，且提取的胶原蛋白中可能存在诸如朊病毒、hiv、口蹄疫病毒等病原体污染的风险。因此，目前迫切需要找到一种安全可靠的胶原蛋白生产方式，而基因工程技术作为一种新型方法，由于具有生产周期短、生产成本低、能快速放大规模等优点，基因工程重组表达胶原蛋白技术可以大大缓解动物养殖和环境保护等方面的压力，基因工程技术生产胶原蛋白的基因可以来源于任何哺乳动物，且对来源的基因改造后可以在大肠杆菌、酵母细胞和动物细胞等模式生物中表达，且经过高密度发酵后可以获得大量的胶原蛋白产品，可以有效解决胶原蛋白大规模生产的瓶颈问题。重组胶原蛋白具有人源胶原蛋白相同的性质，并且重组胶原蛋白具有水溶性强、生物活性高、无免疫源性低和生物相容性高的优点。目前对于重组胶原的制备的报道有很多，主要集中在人源胶原基因的表达，如中国专利cn112552393b公开了一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统，用毕赤酵母gs115诱导发酵40-50h胶原蛋白产量可达4～5g/l；中国专利cn101200718b公开了一种类人胶原蛋白基因、其不同重复数的同向串联基因、含有串联基因的重组质粒及制备方法，该方法对类人源胶原蛋白基因进行重复3～6次后分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达，但其发酵后胶原蛋白的产量和sds-page蛋白电泳图都没提供；中国专利cn111363029a公开了一种重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法，其所构建的重组胶原蛋白含有498个氨基酸，理论分子量为54.5kda，重组胶原蛋白结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，并以此为基础，成功开发出来多种医疗器械产品。中国专利cn111647089a公开了一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用，通过短重复氨基酸序列串联(重复3～10次)构成目的蛋白多肽序列，具有较好的稳定性能，催化活性较单一原始片段保持更久。

4、中国专利201110327865.5构建了一种重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，基因工程菌经发酵培养得到重组人源胶原蛋白，发酵周期为136小时，蛋白表达量为16g/l，发酵水平为0.118g/l·h，蛋白表达量虽有提高，但是发酵周期过长，发酵水平较低。并且在实际生产中，产物在发酵末期出现降解现象，有的批次甚至会降解至3g/l。因此获得稳定性更高的重组人源胶原蛋白仍然是本领域不断追求的目标。

技术实现思路

1、本技术提供一种高效羟基化的重组人源iii型胶原蛋白α1链的序列的方法及其制备工艺。

2、为了克服现有技术的不足和缺点，本发明提供一种简单有效的巴斯德毕赤酵母gs115分泌表达一种高效羟基化的重组人源iii型胶原蛋白α1链的序列的方法，在羟脯氨酸羟化酶前引入来源于人人源ccaat结合蛋白的rebpb的增强子可以使羟脯氨酸酶的表达量更高，细胞内更多脯氨酸羟化酶可以使重组人源iii型胶原蛋白形成三螺旋结构更牢固，进而促进天然结构胶原分子到胶原纤维的自组装，使重组胶原蛋白具有更好的稳定性，经巴斯德毕赤酵母gs115分泌表达生产出的胶原蛋白产量更高，稳定性更好，发酵后期蛋白降解现象显著降低等现象。

3、一种高效羟基化的重组人源iii型胶原蛋白α1链的序列的方法，其特征在于，将来源于人全长ⅲ型胶原蛋白α1链的一段序列(ncbi序列号：np_000081.2)，其序列位于人全长ⅲ型胶原蛋白α1链氨基酸序列的第168至289位氨基酸序列，并重复8次的胶原蛋白片段recol3a1-8、人源ccaat结合蛋白的rebpb增强子片段、草履虫小球藻病毒1(pbcv-1)的脯氨酸羟化酶(p4h)基因片段与表达载体ppic9k进行连接重组后在毕赤酵母中进行发酵表达。

4、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案；

5、一种高效羟基化的重组人源iii型胶原蛋白α1链的序列的方法，包括以下步骤：

6、s1、选择合适的宿主菌、合适的胶原蛋白基因片段、合适来源的增强子基因以及合适来源的脯氨酸羟化酶基因；

7、s2、通过pcr技术对表达载体ppic9k、胶原蛋白片段recol3a1-8、增强子基因片段和脯氨酸羟化酶基因片段进行克隆；

8、s3、制备pichia pastoris gs115感受态细胞。

9、本方法s1所述所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母gs115(pichia pastorisgs115),所述的胶原蛋白片段recol3a1是来源于人全长ⅲ型胶原蛋白α1链的一段序列(ncbi序列号：np_000081.2)，其序列位于人全长ⅲ型胶原蛋白α1链氨基酸序列的第168至289位氨基酸序列，并重复8次，得到胶原蛋白片段recol3a1-8；所述的增强子基因片段是来源于人源ccaat结合蛋白的rebpb(ncbi序列号：np_001272808.1)；所述的脯氨酸羟化酶(p4h)基因序列是来源从草履虫小球藻病1(pbcv-1)的脯氨酸羟化酶(p4h)基因序列(ncbi序列号：np048433.1)。

10、进一步地，所述的胶原蛋白氨基酸序列片段、人源ccaat结合蛋白的rebpb增强子序列和草履虫小球藻病毒1脯氨酸羟化酶序列片段经过密码子优化后进行合成，胶原蛋白对应的氨基酸序列为seq id no.1所示，胶原蛋白对应的核苷酸序列为seq id no.2所示；人源ccaat结合蛋白的rebpb增强子对应的核苷酸序列为seq id no.3；草履虫小球藻病毒1(pbcv-1)的脯氨酸羟化酶(p4h)对应的氨基酸序列为seq id no.4所示，草履虫小球藻病毒1(pbcv-1)的脯氨酸羟化酶(p4h)对应的核苷酸序列为seq id no.5所示。

11、进一步地，s2中克隆方面包括

12、s2-1、通过使用pcr技术并分别使用引物ppic9k-f/r、recol3a1-8-f/r、rebpb-f/r和pbcv-p4h-f/r(seq id no.6)对表达载体ppic9k、胶原片段recol3a1-8、rebpb增强子片段和草履虫小球藻病毒1(pbcv-1)的脯氨酸羟化酶(p4h)基因序列进行pcr克隆来获取连接片段，将克隆得到的胶原蛋白recol3a1-8、rebpb增强子片段、草履虫小球藻病毒1(pbcv-1)的脯氨酸羟化酶(p4h)片段和表达载体ppic9k片段分别按照浓度比为3:4:2:1混合；

13、s2-2、使用gibson assembly无缝连接技术将胶原蛋白片段recol3a1-8、rebpb增强子片段、草履虫小球藻病毒1(pbcv-1)的脯氨酸羟化酶(p4h)基因片段和ppic9k载体骨架片段进行连接，连接成功的重组质粒命名为ppic9k-recol3a1-8-rebpb-pbcv-p4h；

14、s2-3、反应条件为：连接混合物经过50℃金属浴孵育1h，然后将连接混合物通过热激法转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，经过37℃过夜后挑取在含氨苄青霉素钠和卡那霉素平板上生长的阳性单克隆进行菌落pcr初步验证，验证引物用pbcv-p4h-f/r来验证，验证成功的单菌落接种在5ml lb试管中37度培养16h，提取质粒后送测序公司测序来确认重组基因是否与设计一致。

15、进一步地，步骤s3中的感受态制备包括

16、s3-1、电转感受态的制备：按照毕赤酵母山梨醇方法制备感受态细胞；

17、s3-2、取1μg已经线性化的质粒ppic9k-recol3a1-8-rebpb-pbcv-p4h片段与100μl的酵母感受态gs115混匀，混匀后迅速转移到电转杯中进行电击转化以使重组质粒片段进入感受态细胞gs115中；

18、s3-3、将转化后的菌涂布md平板后倒置于30℃恒温培养箱中培养3-4天，直到平板上有单菌落出现，挑取单菌落培养提取基因组进行pcr验证后送去测序来验证转化是否成功；

19、s3-4、对测序验证正确的重组子进行高拷贝重组菌株筛选，既将重组菌分别转染在g418浓度为200μg/ml～2mg/ml的ypd平板上进行刷选，将能在高浓度g418平板上生长的重组菌进行活化后保菌；

20、s3-5、将s3-4中活化菌转接到新的5ml ypd液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养16h；

21、s3-6、以1％的接种量将过夜活化的菌液转接到总体系为50ml的bmgy液体培养基中，30℃，220rpm培养24h；4℃、5000rpm离心10min收集菌体，用100ml的bmmy液体培养基悬浮离心收集的菌体并在30℃，220rpm条件下发酵培养，每隔24h向培养液中添加终浓度为0.5～1％的甲醇进行诱导表达；

22、s3-7、诱导表达72h后将培养液在4℃，12000rpm条件下离心10min，分别收集诱导48h和72h上清液进行sds-page蛋白电泳来验证蛋白表达情况。

23、相比现有技术，本发明的有益效果为：

24、为了克服现有技术的不足和缺点，本发明提供一种简单有效的巴斯德毕赤酵母gs115分泌表达一种高效羟基化的重组人源iii型胶原蛋白α1链的序列的方法，在羟脯氨酸羟化酶前引入来源于人人源ccaat结合蛋白的rebpb的增强子可以使羟脯氨酸酶的表达量更高，细胞内更多脯氨酸羟化酶可以使重组人源iii型胶原蛋白形成三螺旋结构更牢固，进而促进天然结构胶原分子到胶原纤维的自组装，使重组胶原蛋白具有更好的稳定性，经巴斯德毕赤酵母gs115分泌表达生产出的胶原蛋白产量更高，稳定性更好，发酵后期蛋白降解现象显著降低等现象。