一种生产最短脂多糖分子的大肠杆菌的构建与应用

本发明涉及一种生产最短脂多糖分子的大肠杆菌的构建与应用，属于基因工程与生物工程。

背景技术：

1、脂多糖(lps)是革兰氏阴性菌外膜中普遍存在的成分。它通过与宿主防御系统相互作用产生炎症介质，从而增强革兰氏阴性细菌感染的致病过程。lps通常由类脂a和多糖组成。多糖通过3-脱氧-d-甘露聚糖(kdo)连接到类脂a上。在大肠杆菌中，kdo转移酶waaa(也称为kdta)是双功能的，lipidiva在waaa的催化下连续连接上两个kdo分子，生成kdo2-lipidiva；kdo2-lipidiva再经酰基转移酶lpxl和lpxm逐步催化，分别在c2’脂肪酸链和c3’脂肪酸链上连接次级十二烷基和次级十四烷基，从而生成kdo2-lipida。kdo2-lipida分子再经waac和waaf等多个膜相关的糖基转移酶作用，在kdo基团上进一步连接生成多糖长链，并被逐步转运至内膜外侧、外膜内侧，最终形成完整的lps分子，转运定位于外膜外侧。

2、kdo2-lipida的生物合成过程在细菌细胞中是保守的。kdo2-lipida是lps的生物活性中心，可用于开发疫苗佐剂。在过去kdo2-lipida被认为是最小的lps，是细菌生存所必需的。kdo的主要功能是为酰基转移酶lpxl和lpxm提供合适的底物，确保随后的酰化步骤合成五酰化和六酰化的类脂a。waaa缺失后，菌株被证明可以合成由lipidiva衍生物组成的无糖基化内毒素分子，是目前最短的脂多糖结构。这些结构包括四酰化、五酰化和六酰化的类脂a。但缺乏kdo基团的lps的大肠杆菌突变体往往具有条件致死性。目前的办法中，想要避开这种致死表型，需要在低温下进行waaa基因的敲除，但由于waaa基因敲除需要引入抗性基因进行筛选，抗性基因的存在会给后续研究及应用带来不便。waaa基因缺失的菌株无法在30℃以上稳定生长，导致抗性基因的敲除困难。此外，还可以对waaa缺失的菌株进行某些抑制突变或者过表达内膜翻转酶msba或酰基转移酶lpxl来使得waaa基因缺失菌株存活。但通过质粒进行过表达需要加入相应的诱导剂，这使得操作变得困难，也不利于后续在此菌株上进行其他分离纯化或者基因鉴定工作。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明要解决的技术问题是现有技术中waaa基因敲除的大肠杆菌携带有抗性基因，或者需要过表达指定蛋白的技术问题。

3、技术方案

4、为了解决上述存在的问题，本发明在大肠杆菌中敲除了基因组上编码kdo转移酶的基因waaa，同时将该菌株的抗性基因进行了敲除。使得该菌株在无需过表达其他基因，无需添加任何诱导剂及抗生素的条件下能在lb液体培养基中正常生长的同时，能合成最短脂多糖。

5、本发明的第一个目的是一种敲除大肠杆菌waaa基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

6、(1)构建含有waaa基因上下游同源臂和任意抗性片段的重组基因敲除质粒；

7、(2)制备带有red重组辅助质粒的大肠杆菌感受态细胞；

8、(3)将步骤(1)中的重组基因敲除质粒转入步骤(2)中的大肠杆菌感受态细胞，通过相应的抗性筛选得到waaa删除且含有抗性盒的突变菌株；

9、(4)将步骤(3)中的菌株通过低温传代筛选，丢失步骤(2)中辅助质粒；

10、(5)将步骤(4)中得到的菌株转入带有重组酶flp的质粒，通过另一种抗性筛选得到阳性菌株；

11、(6)将步骤(5)中得到的阳性菌株在无抗性平板上筛选，得到waaa完全删除且不含任何抗性筛选标记的缺失菌株；

12、其中，所述方法在每一步骤中均采用20-25℃温度条件进行。

13、在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌w3110。

14、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的重组基因敲除质粒包括pbluescript ii sk(+)。

15、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的red重组辅助质粒包括质粒pkd46。

16、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中的低温传代优选为22℃传代。

17、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的重组酶flp的质粒包括以质粒pcp20为载体，表达重组酶flp。

18、在本发明的一种实施方式中，所述waaa基因序列的ncbi登录号为nc_007779.1:3830598-3831875。

19、本发明的第二个目的是提供一种能够生产最短脂多糖的大肠杆菌，所述大肠杆菌是通过上述方法制备得到的。

20、在本发明的一种实施方式中，所述最短脂多糖的结构为由lipid iva衍生物组成的无糖基化脂多糖。

21、在本发明的一种实施方式中，所述lipid iva衍生物包括：五酰化类脂a与六酰化类脂a。

22、本发明的第三个目的是提供一种提取最短脂多糖的方法，所述方法包括以下步骤：

23、(1)将上述大肠杆菌培养，得到的菌液转接到培养基中；

24、(2)扩大培养后收集菌体，提取脂质；

25、在本发明的一种实施方式中，所述菌液为过夜培养的菌液，转接后od600＝0.01-0.05。

26、在本发明的一种实施方式中，所述培养的温度优选为22℃。

27、在本发明的一种实施方式中，所述提取脂质采用bligh-dyer体系进行提取。

28、本发明的第四个目的是提供上述大肠杆菌鉴定外源编码kdo转移酶的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

29、(1)利用表达载体在上述大肠杆菌中表达被鉴定基因，获得重组菌株；

30、(2)诱导表达、提取总脂质与类脂a；

31、(3)通过lc-ms鉴定步骤(2)中类脂a结构，当lc-ms显示出添加了kdo单位类脂a的离子峰时，被鉴定基因为编码kdo转移酶的基因。

32、在本发明的一种实施方式中，所述编码kdo转移酶的基因来源于革兰氏阴性菌。

33、在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括pbad33。

34、在本发明的一种实施方式中，所述诱导表达的诱导剂包括l-阿拉伯糖。

35、本发明的第五个目的是提供上述大肠杆菌在鉴定其他菌株来源的编码kdo转移酶基因中的应用。

36、在本发明的一种实施方式中，所述应用为先利用表达载体在上述大肠杆菌中表达编码kdo转移酶的基因获得重组菌株，并诱导表达、提取总脂质与类脂a，再通过lc-ms鉴定编码kdo转移酶的基因。

37、本发明还提供上述大肠杆菌在制备疫苗佐剂中的应用。

38、有益效果

39、(1)本发明的生产最短脂多糖分子的基因工程菌，无需过表达任何基因，能在不添加任何诱导试剂及抗生素的情况下生物合成最短脂多糖结构，简化了操作步骤及降低了操作成本。

40、(2)本发明的基因工程菌可以快速有效的鉴定其他菌株来源的kdo转移酶编码基因或类脂a次级酰基链转移酶基因。也可以作为底盘菌株进行脂多糖结构的进一步改造以开发疫苗佐剂。