一种基于大麦黄叶基因HvYGL8的分子标记及应用

本发明涉及基于大麦黄叶基因hvygl8的研究领域，特别涉及基于大麦黄叶基因hvygl8的分子标记及应用。

背景技术：

1、大麦(hordeumvulgare l.)是禾本科大麦属一年生草本作物，全球种植面积仅次于小麦、水稻和玉米，全球排名第四，在农业生产中占有重要地位。大麦主要用作啤酒原料、饲料和粮食，随着农业旅游和乡村旅游的迅速发展，观赏农作物产业也随之孕育而生，彩色大麦在美丽乡村建设中发挥重要作用。大麦叶片通常呈现绿色，这是由叶绿素等色素负责，彩色大麦一般是由于基因突变导致叶片中叶绿素含量减少，而呈现白色或淡黄色等颜色。虽然叶色突变在视觉上具有吸引力，但会引起大麦合作用能力降低，最终会影响产量、株高、千粒重等重要农艺性状。由于不明确大麦叶片颜色的调控基因，缺少相应的分子标记，彩色大麦种质资源的利用和品种改良往往还停留在初级阶段，一般通过将彩色大麦与其他农艺性状优良的品种进行杂交，在后代中筛选同时保留叶片颜色和优良农艺性状的后代，盲目性强、工作量大、土地和人力成本高。

2、高等植物体内叶绿素合成是一个复杂的过程，除了受如光照、稀土元素等外部环境影响以外，其内在的基因调控也十分重要。迄今，从l-谷氨酰-trna到叶绿素a和叶绿素b的生物合成途径均发生在叶绿体中，涉及15个合成步骤的酶已经全部被识别，其中任何一种酶基因突变或被抑制活性均可能导致叶绿素含量变化，影响叶片颜色。除了直接参与叶绿素合成相关的基因，一些基因可能通过影响叶绿体的发育，间接影响叶绿素合成途径基因表达，最终引起叶片叶色的改变。水稻ygl8基因编码叶绿体定位的ump激酶，该基因编码区671位胞嘧啶核苷酸c碱基突变为胸腺嘧啶核苷酸t，引起叶绿体发育不全，叶绿素合成相关基因表达下调，最终导致水稻黄叶表型。

3、ems(ethyl methanesulfonate)诱变技术是一种常用的遗传学研究方法，通常通过将植物种子或动物生殖细胞暴露在含有ems的溶液中来进行处理。ems会引发dna中的碱基转换，特别是腺嘌呤核苷酸(a)和鸟嘌呤核苷酸(g)之间的碱基对转换，这些碱基转换会导致dna中的点突变，从而产生新的遗传变异。ems诱变是一种随机诱变方法，可以产生大量的突变体，为生物学研究提供了丰富的遗传资源。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供，一种基于大麦黄叶基因hvygl8的分子标记及应用，针对以上问题，本发明利用ems诱变技术获得黄叶表型的大麦突变体株系，利用bsa-seq技术、rna-seq技术、qrt-pcr等实验手段，证明大麦hvygl8基因中第5个内含子5’端内含子剪接识别鸟嘌呤核苷酸g突变为腺嘌呤核苷酸a，导致hvygl8基因发生可变剪接，成熟mrna包含了内含子30个碱基，翻译后蛋白多出10个氨基酸，影响了hvygl8蛋白的功能，最终导致了大麦黄叶的表型。本发明针对hvygl8基因中第5个内含子5’端内含子突变位点设计引物，可有效区分黄叶表型和正常绿色表型的大麦，本发明获得的标记可用于育种亲本材料、分离世代群体的早期筛选，减少待鉴定材料植株的种植与鉴定规模，大大降低鉴定过程中的工作量和物力财力的投入，提高选择效率，此外，该标记可用于进行分子标记辅助育种，提高复杂性状的遗传改良效率。实验中需要用到待测材料的dna，该dna可以从待测材料的种子、苗期叶片或者生长中后期大麦植株中提取获得。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案为：

3、基于大麦黄叶基因hvygl8的分子标记及应用，所述大麦黄叶基因hvygl8的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、基于大麦黄叶基因hvygl8的分子标记，该分子标记具体为hvygl8基因中第5个内含子5’端内含子突变位点：针对该位点的特异引物，如seq id no.2-4所示：

5、f:5’-tcctctgcggattacattgg-3’

6、mr:5’-aagattaaggacaaacttac-3’

7、hr:5’-aagattaaggacaaacttat-3’。

8、所述分子标记及引物在区分黄叶表型和正常绿色表型的大麦方面的应用。

9、所述分子标记及引物在育种亲本材料、分离世代群体的早期筛选方面的应用。

10、方案一：大麦黄叶表型调控基因挖掘与分子标记开发

11、为了挖掘大麦黄叶表型的调控基因，发明人利用ems诱变技术，用0.42％的ems试剂人工诱变大麦品种morex的种子，田间种植，对m1代种子进行混收。在m2代植株中筛选黄叶表型突变体，随后对黄叶突变体进行单粒播种繁种，经过7代筛选得到相对稳定的黄叶突变体株系ygl8。发明人将ygl8与亲本morex进行杂交正反交，发现f1代株系叶片全部为绿色，f2代群体中叶片绿色/黄色的分离符合3：1(150株绿色:40株黄色，χ2＝1.37<χ20.05,1＝3.84)，这些结果表明ygl8株系黄叶表型受到一对隐性基因调控。

12、发明人对30株黄叶表型的ygl8株系提取dna，等量混合后进行30x的bulkedsegregant analysis(bsa)-seq混池测序，同时对最初用于ems诱变的morex亲本也进行30x的全基因组重测序，以morex为参考基因组，利用snp-index的计算方法，寻找调控黄叶表型的基因。发明人一共检测到4313个snp-index值为1的位点，其中分布在基因区的位点共有130个，涉及129个候选基因。

13、发明人对田间种植的ygl8和morex叶片进行rna-seq测序，发现候选的129个候选基因中只有59个基因rna-seq样品中有表达，结合morex基因功能注释以及snp引起的基因突变类型，最终将chr3h:609476832-609480518上的horvu.morex.r3.3hg0325830作为候选基因，根据其水稻同源基因，将大麦黄叶表型调控候选基因命名为hvygl8。

14、rna-seq结果显示，hvygl8基因中第5个内含子5’端内含子剪接识别鸟嘌呤核苷酸g突变为腺嘌呤核苷酸a，导致hvygl8基因发生可变剪接，成熟mrna包含了内含子30个碱基，翻译后蛋白多出10个氨基酸。发明人提取morex和ygl8叶片rna,利用pcr手段扩增horvu.morex.r3.3hg0325830全长编码区进行sanger测序，结果与rna-seq一致，ygl8中horvu.morex.r3.3hg0325830编码区较morex基因多30个碱基。

15、发明人在苗期检测了morex和ygl8叶绿体素合成基因的表达和叶绿素含量，结果显示这些叶绿素合成的基因在ygl8中表达均显著下调，同时叶绿素a/b以及类胡萝卜素均降低，说明hvygl8基因内含子5的可变剪接，影响了hvygl8蛋白功能，进而影响叶绿素合成，最终导致叶片黄叶表型。

16、针对hvygl8基因中第5个内含子5’端内含子突变位点设计特异引物，发明人设计特异性引物如下：

17、f:5’-tcctctgcggattacattgg-3’

18、mr:5’-aagattaaggacaaacttac-3’

19、hr:5’-aagattaaggacaaacttat-3’

20、其中f与mr的引物组合可以特异性地从morex基因组上扩增得到920bp的片段，而不能从ygl8基因组上扩增出条带；f与hr的引物组合可以特异性地从ygl8基因组上扩增出920bp的片段，而不能从morex基因组上扩增出条带。

21、方案二：影响大麦黄叶表型基因分子标记在后代群体中的验证

22、利用上述2种引物组合对f1代材料进行扩增，发现f1代材料在2种引物组合中均可以扩增出920bp的片段，表明horvu.morex.r3.3hg0325830在f1代材料中处于杂合状态。在f2代群体材料黄叶表型材料只有在f于hr引物组合下才能扩增出920bp片段，而绿叶表型材料一部分只能在f与mr引物组合下才能扩增出片段，有部分材料在2种引物组合下均能扩增出条带。可见，可以利用2种引物组合判断遗传材料中控制黄叶表型基因的基因型，用于材料早期筛选。

23、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

24、针对彩色大麦叶片调控基因和分子标记挖掘不足的问题，本发明人所在课题组利用0.42％的ems试剂人工诱变大麦品种morex的种子，田间种植，对m1代种子进行混收。在m2代植株中筛选黄叶表型突变体，随后对黄叶突变体进行单粒播种繁种，经过7代筛选得到相对稳定的黄叶突变体株系ygl8。发明人将ygl8与亲本morex进行杂交正反交，发现f1代株系叶片全部为绿色，f2代群体中叶片绿色/黄色的分离比为3：1，说明ygl8株系黄叶表型受到一对隐性基因调控。发明人对30株黄叶表型的ygl8株系提取dna，等量混合后进行30x的bulked segregant analysis(bsa)-seq混池测序，同时对最初用于ems诱变的morex亲本也进行30x的全基因组重测序，以morex为参考基因组，利用snp-index的计算方法，寻找调控黄叶表型的基因。发明人一共检测到4313个snp-index值为1的位点，其中分布在基因区的位点共有130个，涉及129个候选基因。发明人对田间种植的ygl8和morex叶片进行rna-seq测序，发现候选的129个候选基因中只有59个基因rna-seq样品中有表达，结合morex基因功能注释以及snp位点引起的基因突变类型，最终将chr3h:609476832-609480518上的horvu.morex.r3.3hg0325830作为候选基因，根据其水稻同源基因，将大麦黄叶表型调控候选基因命名为hvygl8。rna-seq结果显示，hvygl8基因中第5个内含子5’端内含子剪接识别鸟嘌呤核苷酸g突变为腺嘌呤核苷酸a，导致hvygl8基因发生可变剪接，成熟mrna包含了内含子30个碱基，翻译后蛋白多出10个氨基酸。发明人在morex和ygl8检测了叶绿体素合成基因的表达和叶绿素含量，结果显示这些叶绿素合成的基因在ygl8中表达均显著下调，同时叶绿素a/b以及类胡萝卜素均降低，说明hvygl8基因内含子5的可变剪接，影响了hvygl8蛋白功能，进而影响叶绿素合成，最终导致叶片黄叶表型。针对hvygl8基因中第5个内含子5’端内含子突变位点设计特异引物，可有效区分黄叶表型和正常绿色表型的大麦，本发明获得的标记可用于育种亲本材料、分离世代群体的早期筛选，减少待鉴定材料植株的种植与鉴定规大大降低减低鉴定过程中的工作量和物力财力的投入，提高选择效率，此外，该标记可用于进行分子标记辅助育种，提高复杂性状的遗传改良效率。