一种热稳定性转氨酶突变体及其工程菌与应用

本发明属于生物工程，涉及一种来自嗜热假单胞菌(pseudomonasthermotolerans)的ω-转氨酶突变体。

背景技术：

1、草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等优点，其发挥活性作用的速度比百草枯慢而优于草甘膦，成为与草甘膦和百草枯并存的非选择性除草剂，应用前景广阔。草铵膦又称草丁膦，化学名为4-[羟基(甲基)膦酰基]-dl-高丙氨酸或2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵，为白色结晶，有轻微气味。熔点为210℃，760mmhg下沸点为519.1℃。易溶于水，22℃时在水中溶解度为1370g/l，在常见的有机溶剂中溶解度较低。草铵膦具有手性，通常生产的是l型和d型的外消旋体，后续研究发现只用l-草铵膦具有除草作用，而d型则几乎无活性。若制成仅有l-草铵膦纯光学异构体的产品进行使用，可使草铵膦的用量减少一半，提高经济性、降低使用成本减轻环境压力。

2、草铵膦的合成主要分为化学合成法和生物酶法两大类：化学合成法主要以甲基二氯化磷或亚磷酸酯为起始原料，通过烷基化、重排、氰胺化、铵化、酸解、纯化等一系列的反应最终生成磷酸酯，然后与某些氨基衍生物发生反应制得草铵膦。但是化学合成l-草铵膦通常步骤冗长，合成路线复杂，产率和对映体选择性比较低。而相比于化学合成法生成l-草铵膦，生物酶法生成l-草铵膦具有反应条件温和、收率高、产物易分离纯化且具有严格的立体选择性等优点，因此研究生物酶法生产l-草铵膦具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。

3、转氨酶(transaminase)是可逆催化氨基转移的一类酶。能够催化手性胺的不对称合成，通过胺基从胺供体转移到酮或醛受体，以plp为辅因子。根据折叠类型，plp依赖性酶分为7大类，转氨酶属于折叠类型i和iv。转氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸，这些手性化合物常作为药品的活性成分或主要中间体被使用，例如，广谱触杀型除草剂草铵膦、治疗糖尿病药物的西他列汀以及抗生素青霉素等，在制药业、农业、化工业都有重要的作用。转氨酶催化的转氨反应主要分为动力学拆分和不对称合成，以酮酸为底物的不对称合成生产非天然氨基酸具有100％理论产率，对映选择性高，催化活力好的优点。但是目前在利用转氨酶合成l-草铵膦的工艺中存在热力学平衡、产物转化率低、酶活性低、底物耐受性差等问题，不利于转氨酶合成l-草铵膦工艺的工业化生产。且目前报导的用于不对称合成l-草铵膦的转氨酶是基于活力筛选的，稳定性及底物耐受性不是首要考虑因素。

技术实现思路

1、本发明提供了一种催化活力高、底物浓度和有机溶剂耐受性高的ω-转氨酶突变体，其通过以下技术方案实现：

2、一种来源于嗜热假单胞菌(pseudomonas thermotolerans)的ω-转氨酶突变体，所述ω-转氨酶突变体由seq id no.1所示氨基酸序列的第23位的组氨酸取代为丙氨酸，第43位的酪氨酸取代为天冬氨酸，第128位的精氨酸取代为丝氨酸，第214位的苯丙氨酸取代为半胱氨酸得到。

3、所述seq id no.1所示氨基酸序列对应的编码基因核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、作为优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。

5、由于氨基酸序列的特殊性，任何seq id no.3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在80％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

6、作为进一步优选，所述ω-转氨酶突变体的核苷酸序列如seq id no.4所示。

7、由于核苷酸序列的特殊性，任何seq id no.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有80％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的突变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的突变体可以是等位变异体或非等位变异体，如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变编码氨基酸的功能。

8、一种包含有上述ω-转氨酶突变体的编码基因的重组质粒。

9、所述重组质粒是将ω-转氨酶突变体的编码基因插入pet28a(+)载体得到。

10、一种包含有上述ω-转氨酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。

11、所述重组基因工程菌是将重组质粒转化进宿主菌细胞获得的，所述宿主菌包括e.coli bl21(de3)细胞或能表达该酶的宿主细胞。

12、作为优选，所述重组基因工程菌还含有氨基酸脱氢酶gludh和乙醇脱氢酶adh的编码基因。

13、上述ω-转氨酶突变体在生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸不对称合成l-草铵膦中的应用。

14、一种l-草铵膦制备方法，将包含有ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后经镍柱纯化得到的纯酶液作为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以l-谷氨酸为氨基供体，于ph6.0～10.0缓冲液中构成转化体系，在25～75℃、400～600r/min条件下反应，得到反应液，反应液经分离纯化得到l-草铵膦。

15、作为优选，催化剂加入量为1-10u/ml，进一步优选为4u/ml；辅酶用量为0.02～25mm，进一步优选为0.1～2mm，更优选为1mm；底物ppo的初始浓度为10～160mm，优选为20～100mm，更优选为20mm；氨基供体加入量为30～100mm，优选为60mm；所述反应介质优选ph8.0的50mm pb缓冲液。

16、一种l-草铵膦制备方法，将包含有ω-转氨酶突变体编码基因、氨基酸脱氢酶gludh和乙醇脱氢酶adh的编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，l-谷氨酸氨基供体，异丙醇为辅底物，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为氧化还原辅因子，加入磷酸吡哆醛，于ph6.0～8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在35～55℃反应8～24h，得到反应液，反应液分离纯化得到l-草铵膦。

17、本发明乙醇脱氢酶adh可以为本领域已知的任何具有催化辅因子nad+发生氧化反应，生成nadh的脱氢酶，实现氧化还原辅因子循环，该反应需要辅底物的存在。

18、本发明所述ω-转氨酶突变体、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的加入形式可以为纯化的酶，超声破碎的粗酶液，湿菌体，固定化的菌体，固定化的酶，完整的发酵液或其任意组合。

19、作为优选，反应条件为50℃反应10h。

20、作为优选，反应ph值优选为7.0～8.0，更优选ph值为8.0。优选ph值为6.5～8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，ph值为8.0～9.5的tris-盐酸缓冲液，更优选为ph值为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

21、作为优选，所述氨基供体还包括硫酸铵或甲酸铵中的一种。

22、所述反应体系中，催化剂加入终浓度以湿菌体重量计为5～50g/l，优选为10～15g/l；底物加入终浓度为50～300mm，优选为50mm；所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸加入终浓度为0.05～1.0mm，优选为0.1mm；所述磷酸吡哆醛加入终浓度为0.05～1.0mm，优选0.1mm；所述氨基供体l-谷氨酸加入终浓度为5～100mm，优选10mm。所述氨基供体硫酸铵或甲酸铵加入终浓度为20～300mm，优选75mm。所述异丙醇加入终浓度为25～300mm，优选65mm。

23、本发明相较于现有技术具有以下有益效果：

24、本发明提供了一种新的ω-转氨酶突变体，酶活可达45.53u/mg。该突变体对草铵膦前体酮酸ppo具有较高的催化活力，可催化底物ppo转化为l-草铵膦，200mm底物反应3h，底物转化率为88.58％，产物ee>99.9％，相比较于野生型，ω-转氨酶突变体对ppo的特异性活性提高了1.8倍，其最适反应温度为55℃，最适ph为8.0，为耐高温嗜热稳定性较好的菌株。此外，在本发明中，还采用了三酶级联法，gludh及adh的引入提高了转化效率，可催化底物ppo转化为l-草铵膦，300mm底物反应10h，底物转化率为100％，产物ee>99.9％，在生产l-草铵膦中具有较好的应用前景。

25、序列描述

26、seq id no.1为来源于嗜热假单胞菌pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-ta的氨基酸序列。

27、seq id no.2为来源于嗜热假单胞菌pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-ta的核苷酸序列。

28、seq id no.3为来源于嗜热假单胞菌pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-ta突变后的氨基酸序列。

29、seq id no.4为来源于嗜热假单胞菌pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-ta突变后的核苷酸序列。

30、seq id no.5为来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌geobacillus stearothermophilus的谷氨酸脱氢酶gludh的氨基酸序列。

31、seq id no.6为来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌geobacillus stearothermophilus的谷氨酸脱氢酶gludh的核苷酸序列。

32、seq id no.7为来源于红球菌rhodococcus ruber的乙醇脱氢酶adh的氨基酸序列。

33、seq id no.8为来源于红球菌rhodococcus ruber的乙醇脱氢酶adh的核苷酸序列。