脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物的制作方法

本发明涉及脂肪酶变体、编码这些变体的多核苷酸以及产生所述变体的方法。本发明还涉及包含本发明的脂肪酶变体的组合物和微囊组合物以及包含本发明的微囊组合物的液体产品。

背景技术：

1、脂肪酶是重要的生物催化剂，其已经示出对于不同应用是有用的。以商品名lipolasetm出售的野生型疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)(同义词疏棉状腐质霉(humicola lanuginosa))脂肪酶及其变体已被商业化为洗涤剂组合物中的活性成分，用于通过水解甘油三酯生成脂肪酸来去除脂质污渍。

2、洗涤剂、清洁和/或织物护理组合物包含干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力的活性成分。具有良好洗涤性能的许多已知的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体在洗涤期间形成产生气味的短链脂肪酸和/或具有短的储存稳定性。

3、因此，仍然需要和期望具有改善的洗涤性能、减少的气味产生和/或改善的储存稳定性/更长的保存期限/增加的热稳定性的脂肪酶。

技术实现思路

1、本发明涉及亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性，与seq id no:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于g23s、d27n、a40i、f51i,l、e56r、d57n、v60e,k、k98i、n101d、r118f、g163s、y220f、t231r、n233r、t244e和p256t的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。

2、此外，本发明涉及包含本发明的脂肪酶变体的组合物及其在水解脂质底物中的用途。此外，本发明涉及编码本发明的变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；

3、在一方面，本发明涉及微囊组合物，其中该微囊的膜通过使具有高于1kda分子量的多支化的多胺交联而产生，其中该微囊包含本发明的脂肪酶变体。

4、在又一方面，本发明涉及微囊组合物，这些微囊组合物包含被截留在由膜形成的隔室中的本发明的脂肪酶变体，该膜通过使(a)具有高于800da分子量的多支化的多胺和(b)具有小于300da分子量的脂肪胺或芳香胺的交联而产生；其中(a)/(b)的重量比在0.1至1000的范围内。

5、最后，本发明涉及包含本发明的微囊组合物的液体产品。

6、定义

7、脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂肪分解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的ec3.1.1类中的酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，ec3.1.1.3)、角质酶活性(ec3.1.1.74)、固醇酯酶活性(ec3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(ec3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一方面，本发明的变体具有至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％的seq id no:2的多肽的脂肪酶活性。

8、等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体位点的基因的两种或多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可能导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

9、cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。初始的初级rna转录物是mrna的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mrna。

10、编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束。编码序列可为基因组dna、cdna、合成dna或其组合。

11、控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

12、表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

13、表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

14、片段：术语“片段”意指具有在多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段包含seq id no:2的氨基酸1至269的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但是小于100％。

15、高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2x ssc、0.2％ sds将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

16、宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

17、改善的特性：术语“改进的特性”意指与相对于亲本脂肪酶有所改进的变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于洗涤剂稳定性、具有存在蛋白酶的洗涤剂中的稳定性、蛋白酶稳定性、化学稳定性、氧化稳定性、ph稳定性、储存条件下的稳定性、以及热稳定性。

18、分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

19、低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃、于5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2x ssc、0.2％ sds将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

20、成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后呈其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是seqid no:2的氨基酸1至269。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。

21、成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是seq id no:1的核苷酸1至807。

22、中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃、于5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2x ssc、0.2％ sds将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

23、中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃、于5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2x ssc、0.2％ sds将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

24、突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

25、核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的、或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段、或是合成的，其含有一个或多个控制序列。

26、可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被置于相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得控制序列引导编码序列的表达。

27、亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指一种脂肪酶，对该脂肪酶进行改变以产生本发明的酶变体。该亲本脂肪酶可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

28、序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。

29、出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(the european molecular biology open software suite)，rice等人，2000，trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(needle)程序中所实施。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

30、(相同的残基数×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

31、出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人，2000，同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

32、(同一的脱氧核糖核苷酸数×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

33、稳定性：本发明的脂肪酶变体的稳定性可以表示为在暴露于不同测试条件(例如储存在洗涤剂组合物中、在不同温度、在不同ph、在不同组分(例如蛋白酶、化学品、和/或氧化物质(压力条件)的存在下)期间或之后或在用于洗涤过程期间，所述脂肪酶的残余活性或残余性能。脂肪酶变体的稳定性可以相对于亲本脂肪酶(例如示为seq id no:2的脂肪酶)的已知活性或性能，或替代性地相对于最初添加到任选地冷藏或冷冻储存的洗涤剂组合物时的变体脂肪酶的已知活性或性能，或相对于冷藏或冷冻储存的(无压力条件)脂肪酶变体来测量。

34、子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5′端和/或3′端缺失的一个或多个(例如若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一方面，子序列包含seq id no:1的核苷酸1至807的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％，但是小于100％。

35、变体：术语“变体”意指具有脂肪酶活性的、在一个或多个(例如若干个)位置包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的这些变体具有seq id no:2的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的脂肪酶活性。

36、非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2x ssc、0.2％ sds将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

37、非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃、于5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2x ssc、0.2％ sds将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

38、野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的脂肪酶。

39、变体命名惯例

40、出于本发明的目的，使用作为seq id no:2披露的多肽来确定另一种脂肪酶中的相应的氨基酸残基。另一种脂肪酶的氨基酸序列与seq id no:2进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于seq id no:2中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人，2000，trends genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。

41、可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种脂肪酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于muscle(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；edgar,2004,nucleic acids research[核酸研究]32:1792-1797)，mafft(版本6.857或更新版本；katoh和kuma,2002,nucleic acidsresearch[核酸研究]30:3059-3066；katoh等人,2005,nucleic acids research[核酸研究]33:511-518；katoh和toh,2007,bioinformatics[生物信息学]23:372-374；katoh等人,2009,methods in molecular biology[分子生物学方法]537:39-64；katoh和toh,2010,bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用clustalw的emboss emma(1.83或更新版本；thompson等人,1994,nucleic acids research[核酸研究]22:4673-4680)。

42、当其他酶与seq id no:2的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(lindahl和elofsson,2000,j.mol.biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，psi-blast程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(atschul等人,1997,nucleic acids res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.[分子生物学杂志]287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(psi-blast、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，gough等人,2000,j.mol.biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于scop数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

43、对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的scop超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(holm和sander,1998,proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(shindyalov和bourne,1998,protein engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

44、在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的iupac单字母或三字母的氨基酸缩写。

45、取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“thr226ala”或“t226a”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(g)和丝氨酸(s)分别被精氨酸(r)和苯丙氨酸(f)取代。

46、缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“gly195*”或“g195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。

47、插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“gly195glylys”或“g195gk”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“gly195glylysala”或“g195gka”。

48、在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：

49、 <![cdata[<u>亲本：</u>]]> <![cdata[<u>变体：</u>]]> 195 195 195a 195b g g-k-a

50、多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

51、不同改变.可以在一个位置处引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“arg170tyr,glu”或“r170y,e”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”表示以下变体：

52、“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”。