结缕草耐盐基因ZjCHI1及其植物表达载体和应用

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及结缕草耐盐基因zjchi1及其植物表达载体和应用。

背景技术：

1、土壤盐碱化是一个世界性的问题，盐碱化地区由于盐碱含量高，严重限制植物的生长，但盐碱地是重要的后备土地资源，培育耐盐植物新品种，是盐碱地改良、开发利用的有效措施和重要途径。传统的杂交育种、辐射诱变育种等在抗逆植物新品种培育方面做出了巨大贡献，然而存在周期长、效率低等不足，近年来，随着分子生物学的迅速发展，挖掘优异抗逆基因，通过快速高效的基因工程技术，将优异基因在植物体内过量表达以提高植物抗逆性已成为现代育种的重要手段。

2、几丁质酶(chitinase)是一类糖苷水解酶，研究表明，植物几丁质酶(chitinase)是响应生物和非生物胁迫的一种重要蛋白，且在响应盐胁迫和耐盐性调控过程中有着重要的作用。研究发现，拟南芥几丁质酶的活性在紫外线、热休克、盐胁迫、机械损伤时被诱导(lima et a1.,2002；gerhardt et a1.,2004；kwon et al.,2007)；四棱豆的几丁质酶(class i，chitinase)基因(chitiwb1)在nacl的胁迫下表达上调(tateishi et al.,2001)；芥菜(brassica juncea)几丁质酶基因(bjchi)表达受nacl的胁迫高度诱导(wu etal.,2009)；将渗透调节蛋白(olp)和几丁质酶基因(chil1)遗传转化西红柿，发现转基因植株的脯氨酸含量、k+含量、相对含水量、叶绿素荧光、生物量和果实产量等都高于野生型(kumar et al.,2016)。

3、本发明通过gwas关联技术从结缕草中获得了一个耐盐候选几丁质酶基因zjchi1，该基因与粟米同源基因的同源性最高，为59.72％；与其他单子叶植物高粱、水稻、玉米和黍的同源性分别为56.18％、53.71％、52.30％与54.77％，与双子叶植物拟南芥和烟草的同源性均为44.17％。由此，我们获得的zjchi1是一个新的耐盐候选基因；本发明的动因就是：将结缕草zjchi1构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，获得具有耐盐特性的新种质；本专利对于优良植物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

4、参考文献：

5、lima vm,magioli c,gerhardt lbda,tarre e,menezes rmg(2002)bean classⅳchitinase promoter is modulated during plant development and under ahioticstress.physiol plantamm,116(4):512-521.

6、gerhardt lbda,magioli c,perez abucm,margis r,sachetto-martins g(2004)atchitlv gene expression is stimulated under abiotic stresses and isspatially and temporally regulated during embryo development.genet mol biol27:118-123.

7、kwon yr,kim sh,jung ms,kim ms,oh je(2007)arabidopsis hot2 encodes anendochitinase-like protein that is essential for tolerance to heat,salt anddrought stresses.the plant journal 49:184-193.

8、tateishi y,umemura y,esaka m(2001)a basic class i chitinaseexpressing in winged bean is up-regulated by osmotic stress.biosci biotechnolbiochem 65:1663-1668.

9、wu xf,wang cl,xie eb,gao y,fan yl et al.(2009)molecular cloning andcharacterization of the promoter for the multiple stress-inducible genebjchi1 from brassica juncea.planta229:1231-1242.

10、kumar sa,kumari ph,jawahar g,prashanth s,suravajhala p,et al.(2016)beyond just being foot soldiers-osmotin like protein(olp)and chitinase(chi11)genes act as sentinels to confront salt,drought,and fungal stress tolerancein tomato.environmental and experimental botany132:53-65.

技术实现思路

1、针对背景技术提出的培育耐盐植物新种质的问题，本发明的目的在于提供一个新的结缕草耐盐基因zjchi1及其应用，该基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2、本发明的另一目的在于提供一种含有上述结缕草耐盐基因zjchi1的生物材料及其应用。

3、本发明的又一目的在于提供一种提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质的方法。本发明所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制耐盐新种质，可用于植物品种改良。

4、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

5、第一方面，本发明提供一种结缕草耐盐基因zjchi1，该基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。

6、第二方面，本发明提供含有上述结缕草耐盐基因zjchi1的生物材料；进一步的，所述的生物材料为重组载体、表达盒，转基因细胞系或重组菌。

7、进一步优选的，所述的重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。

8、更进一步优选的，所述的重组表达载体为将上述的结缕草耐盐基因zjchi1插入植物表达载体构建得到的结缕草耐盐基因zjchi1植物表达载体。

9、更进一步优选的，所述的重组表达载体为将带有同源重组臂的zjchi1基因片段与线性化后的pcambia1305.1表达载体质粒进行同源重组反应得到的结缕草耐盐基因zjchi1植物表达载体。具体的，载体构建是使用clonexpress iione step cloning kit(vazyme,nanjing)同源重组克隆法，以bamhi为单酶切位点，与pcambia-1305表达载体质粒进行重组反应得到。

10、在本发明的具体实施方式中，所述结缕草耐盐基因zjchi1植物表达载体的构建方法包括如下步骤：

11、(1)以结缕草cdna为模板，设计引物zjchi1-f和zjchi1-r，进行pcr反应，将pcr产物连接到pmd19-t载体，转化dh5α感受态细胞，提取阳性质粒；

12、上游引物zjchi1-f：5′-atggcgaattcaccatggccgacgaac-3′(seq id no.2)，

13、下游引物zjchi1-r：5′-ctagcaggtgaggttgccccccgggtcg-3′(seq id no.3)，

14、(2)以提取的阳性质粒为模板，设计植物表达载体pcambia1305.1的构建引物1305-zjchi1-f和1305-zjchi1-r，进行pcr反应，将pcr产物与经bamhi单酶切线性化后的植物表达载体pcambia1305.1质粒进行同源重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pcambia1305.1-zjchi1构建成功；

15、上游引物1305-zjchi1-f：5′-aggaccggtcccgggggatccatggcgaattcaccatggc-3′(seq id no.4)，

16、下游引物1305-zjchi1-r：5′-gcccttgctcaccatggatccgcaggtgaggttgccccc-3′(seq id no.5)。

17、第三方面，用于克隆上述结缕草耐盐基因zjchi1的引物对也属于本发明的保护范围，该引物对的上下游引物如下所示：

18、上游引物zjchi1-f：5′-atggcgaattcaccatggccgacgaac-3′，

19、下游引物zjchi1-r：5′-ctagcaggtgaggttgccccccgggtcg-3′。

20、第四方面，本发明提供一种提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质的方法，该方法为在植物中过表达上述的结缕草耐盐基因zjchi1以提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质。

21、第五方面，上述的结缕草耐盐基因zjchi1，上述的生物材料，或上述的引物对在提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质中的应用也属于本发明的保护范围。

22、进一步的，所述的植物或植物为双子叶植物或单子叶植物；具体的，所述的单子叶植物选自结缕草、粟米、高粱、水稻、玉米和黍；所述的双子叶植物选自棉花、烟草或拟南芥。

23、本发明的有益效果

24、1.本发明提供的结缕草zjchi1是一个新的耐盐基因，该基因可提高植物耐盐性；

25、2.本发明构建的结缕草zjchi1植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐盐新种质，提高植物的耐盐性，可进行植物品种改良。