一种基于高内涵组合分析盘的食品基质中基因毒性物质的筛查检测方法

本发明属于食品中基因毒性物质筛查检测领域，具体涉及了基于高内涵技术应用基因损伤生物标志物组合盘检测食品中基因毒性物质的方法。

背景技术：

1、基因毒性物质能直接或间接损伤细胞dna，导致基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向。基因毒性物质广泛存在于日常生活及环境中，食品中的基因毒性物质给人类食品安全带来了严重威胁，且复杂食品基质中基因毒性物质的体外测试方法目前仍较匮乏，因此建立完善的检测食品中的基因毒性物质方法是当下迫切需求。

2、高内涵筛选技术（high content screening，hcs）使一种以细胞为检测对象，保持细胞结构和功能的完整性，通过荧光显微成像和定量图像分析的一种体外高通量、高灵敏的自动化筛选技术，现已被广泛用作体外毒理学工具来测试化合物毒性和阐明毒性作用机制。现阶段常用的体外基因毒性评价实验主要有细菌回复突变实验、微核实验和彗星实验等。但这些方法存在局限性如低通量，灵敏度低，监测的dna损伤修复机制不完整等。

3、《dna损伤标志物γ-h2ax及其在毒性测试应用中的研究进展》［1］报道了：dna双链断裂（dsb）后，组蛋白h2ax的139位丝氨酸迅速磷酸化，生成磷酸化h2ax即γ-h2ax，且γ-h2ax焦点数与dsb数量成正比。因此，检测γ-h2ax已经被证实可作为评价基因毒性的特异性指标。

4、组蛋白h3的ser-10磷酸化（p-h3）是细胞有丝分裂的生物标志物。非整倍体诱导剂导致细胞有丝分裂延迟，使组蛋白h3的ser-10发生显著磷酸化。目前，已证明p-h3成为潜在的评价非整倍体毒性的生物标志物。《distinct orchestration and dynamic processeson γ-h2ax and p-h3 for two major types of genotoxic chemicals revealed bymass spectrometry analysis》［2］该文献报道了通过稳定同位素稀释-液相色谱-串联质谱（id-lc-ms/ms）对两种主要类型的基因毒性化学物质引起细胞γ-h2ax和p-h3变化的不同动态过程的首次全面表征。该文献的生物标志物为γ-h2ax和p-h3，本技术的生物标志物为γ-h2ax、p-h3、p53和rad51，二者生物标志物不同；该文献的检测方法为液相色谱质谱联用技术检测γ-h2ax和p-h3，与本技术采用的是高内涵筛选技术，二者检测方法不同；另外该研究的是对γ-h2ax和p-h3进行分析可以定量区分致染色体断裂化合物和非整倍体基因毒性化合物，动态地呈现dna损伤和修复过程的细节图谱，本技术的应用是检测食品中的基因毒性物质，检测样本研究目的不同。

5、《complementarity of phosphorylated histones h2ax and h3quantification in different cell lines for genotoxicity screening》［3］报道了一种将γ-h2ax和p-h3组合分析可区分致染色体断裂化合物和非整倍体化合物的方法，应用icw技术，三种具有不同生物转化特性细胞hepg2、ls174t和achn系通过荧光标记γ-h2ax和p-h3，成功的将20种化合物分类。该文献的生物标志物为γ-h2ax和p-h3，本技术的生物标志物为γ-h2ax、p-h3、p53和rad51，二者生物标志物不同；该文献的检测方法为icw检测γ-h2ax和p-h3，与本技术采用的是高内涵筛选技术，二者检测方法不同；另外该研究的应用是对基因毒性物质的筛选和分类，本技术的应用是检测食品中的基因毒性物质，检测样本不同。

6、rad51蛋白是高度遗传保守的dna修复基因，它通过同源重组来修复由于电离辐射等原因造成的dna损伤。当细胞受到基因毒性药物（如丝裂霉素c）、紫外线或电离辐射的损害时，rad51蛋白会聚集到dna断裂处寻找同源序列来进行修复。《顺铂对不同生物学特性鼻咽癌细胞rad51基因表达的影响》［4］该文献通过使用rt-pcr技术检测rad51在不同生物学特性鼻咽癌细胞中的表达情况，探讨rad51是否能成为顺铂治疗鼻咽癌的有效靶点。该文献的生物标志物为rad51，本技术的生物标志物为γ-h2ax、p-h3、p53和rad51，二者生物标志物不同；该文献的检测方法为rt-pcr技术，本技术采用的是高内涵筛选技术，二者检测方法不同；另外该研究为检测顺铂对具有不同生物学特性的鼻咽癌细胞的rad51的影响，本技术的应用是检测食品中的基因毒性物质，检测样本不同。

7、p53是一种肿瘤抑制蛋白，在响应基因毒性损伤的细胞周期停滞、dna修复和细胞凋亡中起重要作用。《assessment of a panel of cellular biomarkers and thekinetics of their induction in comparing genotoxic modes of action in hepg2cells》［5］报道了一种基于γ-h2ax和ph3以及其他六种生物标记物确定受试化合物的基因毒性作用模式的检测方法。该文献的生物标志物为γ-h2ax、p53、p-p53、p21、p-chk1、p-chk2、p-atm和p-h3，本技术的生物标志物为γ-h2ax、p-h3、p53和rad51，二者生物标志物不同；该文献的检测方法为icw检测，与本技术采用的是高内涵筛选技术，二者检测方法不同；另外该研究的目的是研究其他可能的细胞生物标志物从而推断致染色体断裂化合物所涉及的特定机制，本技术的应用是检测食品中的基因毒性物质，研究目的不同。

8、《一种体外多终点遗传毒性检测方法》［6］报道了：将组蛋白γ-h2ax、p53蛋白、磷酸化组蛋白h3（p-h3）以及活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（parp）4个生物标志物整合到γ-h2ax灶点试验中，以经典的致断裂剂依托泊昔、环磷酰胺和非整倍体诱导剂秋水仙素为阳性对照品，以p53基因完整的人成淋巴tk6细胞为试验体系，以流式细胞仪检测γ-h2ax、p53蛋白和p-h3荧光强度；最后采用dna断裂剂丝裂霉素c、甲磺酸甲酯、苯并芘和顺铂，非整倍体诱导剂长春新碱和紫杉醇，不具有遗传毒性的化合物氯化钠、氨节青霉素g和盐酸普萘洛尔对该方法的灵敏度和特性进行验证，证明该方法具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。该文献的生物标志物为γ-h2ax、p53、p-h3以及parp，本技术的生物标志物为γ-h2ax、p-h3、p53和rad51，二者生物标志物不同；该文献的检测方法为以流式细胞仪检测γ-h2ax、p53蛋白和p-h3荧光强度，与本技术采用的是高内涵筛选技术，二者检测方法不同；另外该研究的应用是对药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价，本技术的应用是检测食品中的基因毒性物质，检测样本不同。

9、《高内涵筛选技术联合多能性基因oct4、sox2和nanog检测建立药物胚胎毒性快速筛查方法》［7］报道了：dapi、calcein-am、pi三者共染可以很好地区分活细胞及死细胞；高内涵筛选技术（dapi、calcein-am、pi共染）联合多能性基因的检测可初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。该文献的生物标志物为dapi、calcein-am和pi，与本技术的γ-h2ax、p-h3、p53和rad51，二者生物标志物不同；该文献的应用是对药物胚胎毒性快速筛查，本技术的应用是检测食品中的基因毒性物质，检测样本不同。

10、复杂食品基质中基因毒性物质的体外测试方法目前仍较匮乏，因此建立完善的检测食品中的基因毒性物质方法是当下的迫切需求。

11、参考文献

12、[1]瞿敏敏,陈佳,郭磊等.dna损伤标志物γ-h2ax及其在毒性测试应用中的研究进展[j].中国药理学与毒理学杂志,2021,35(06):401-411.

13、[2]qu m, xu h, chen j, zhang y, xu b, guo l, xie j. distinctorchestration and dynamic processes on γ-h2ax and p-h3 for two major typesof genotoxic chemicals revealed by mass spectrometry analysis. chem restoxicol. 2020 aug 17;33(8):2108-2119.

14、[3]khoury l, zalko d, audebert m. complementarity of phosphorylatedhistones h2ax and h3 quantification in different cell lines for genotoxicityscreening. arch toxicol. 2016 aug;90(8):1983-95.

15、[4]赵淼,高晗,赵九洲等.顺铂对不同生物学特性鼻咽癌细胞rad51基因表达的影响[j].广东医学,2014,35(11):1666-1668.

16、[5]kopp b, dario m, zalko d, audebert m. assessment of a panel ofcellular biomarkers and the kinetics of their induction in comparinggenotoxic modes of action in hepg2 cells. environ mol mutagen. 2018 jul;59(6):516-528.

17、[6]黄鹏程,王敬亭,赵田田,等.一种体外多终点遗传毒性检测方法[j].中国药理学与毒理学杂志， 2021年35卷3期, 201-210页, istic pku cscd ca, 2021.doi:10.3867/j.issn.1000-3002.2021.03.006.

18、[7]鲁娣,宋殿荣,张崴,等.高内涵筛选技术联合多能性基因oct4,sox2和nanog检测建立药物胚胎毒性快速筛查方法[j].药物评价研究, 2022, 45(9):9.

技术实现思路

1、发明所要解决的问题：

2、针对目前常用体外食品中基因毒性评价方法的局限性，将人源化体外培养细胞株用于基因毒性评价，并选用关联不同dna损伤修复途径的生物标志物γ-h2ax、p-h3、p53和rad51构建组合分析盘，同时考察复杂食品基质对组合分析盘检测结果的影响，建立了一种对复杂食品中基因毒性物质的筛查检测新方法，该方法准确度高、灵敏度强，且可有效区分复杂食品基质中的作用机制不同的基因毒性物质。

3、本发明第一方面建立了一种适合基因毒性物质筛查检测的高内涵组合分析盘。步骤如下：

4、a、细胞培养：hepg2、a549和rad51-egfp-sw480细胞分别采用含10%fbs的1640、含10%fbs的f-12k和含10%fbs的高糖dmem培养基于37ºc、5%co2培养箱中培养，定期换液传代。在细胞染毒前16小时，将细胞以每孔1.5×104-2×104个细胞的密度接种在黑色底透96孔板中；

5、b、细胞染毒：吸弃孔板中原有培养基，加入细胞染毒液继续培养；

6、c、染毒细胞的免疫荧光标记或激活表达：将染毒待测细胞与固定液、透膜液、封闭液以及抗体和染料孵育；所述抗体包括γ-h2ax、p-h3和p53抗体；

7、d、高内涵分析

8、使用高内涵成像技术对染毒细胞的γ-h2ax、p-h3、p53和rad51四种生物标志物的表达进行荧光检测和数据分析；

9、根据染毒后细胞的γ-h2ax、p-h3、p53和rad51表达分析高内涵组合分析盘建立的可行性；

10、e、建立高内涵组合分析盘

11、选取γ-h2ax、p-h3、p53和rad51建立高内涵组合分析盘。

12、其中，所述细胞包含hepg2细胞、a549细胞和rad51-egfp-sw480三种不同类型的人源细胞系。

13、上述步骤所述的细胞染毒液为12种不同作用机制、不同浓度的基因毒性模型化合物，具体为叠氮胸苷、一氧化氮喹啉、五氟尿嘧啶、顺铂、喜树碱、丝裂霉素c、依托泊苷、苯丁酸氮芥、长春碱、紫杉醇、灰黄霉素和陶扎色替，见表1。

14、步骤中所涉及的固定液、透膜液和封闭液分别为4%的多聚甲醛溶液、0.1%的triton-100和5%的bsa溶液。

15、通过上述高内涵筛选技术采用基因毒性模型化合物验证了：四种生物标志物γ-h2ax、p-h3、p53和rad51与细胞的dna损伤及修复密切相关。

16、本方明第二方面是利用第一方面建立的高内涵组合分析盘对复杂食品基质中基因毒性物质筛查检测。步骤如下：

17、a、复杂食品基质基因毒性检测阴性对照的制备：食品均破壁粉碎，离心后取上清液，-20℃保存。上清液用无血清无抗生素培养基按1:10、1:100、1:1000进行稀释，作为食品基质基因毒性检测阴性对照。

18、b、复杂食品基质基因毒性检测阳性对照的制备：选用代表性药物mmc（终浓度为0.1μm）或taxol（终浓度为1μm）加入到食品基质中。

19、c、食品基质基因毒性检测阴性对照和阳性对照暴露hepg2细胞24h。

20、d、免疫荧光标记或激活：将上述待测细胞与固定液、透膜液、封闭液以及抗体和染料孵育；所述抗体包括γ-h2ax、p-h3和p53抗体。

21、e、高内涵定量分析：使用高内涵成像技术对添加食品基质作用后的细胞的γ-h2ax、p-h3、p53和rad51四种生物标志物的表达进行荧光检测和数据分析。

22、结果：复杂食品基质对检测生物标志物γ-h2ax、p-h3、p53和rad51均无影响，与基因毒性模型化合物共同孵育后可观测到γ-h2ax、p-h3、p53和rad51荧光强度的增加，表明该生物标志物组合盘可用于检测食品基质中的基因毒性物质。

23、所述的复杂食品基质包括茶、咖啡、西红柿汁、小白菜汁和菠菜汁在内的五种食品基质。

24、本发明第三方面验证了本发明第二方面的检测方法的准确度、灵敏度等结果：dna损伤修复生物标志物γ-h2ax和dna修复生物标志物rad51两者组合考察可提高基因毒性筛查的准确度；γ-h2ax和p53蛋白具相关性，对于多数基因毒性化合物，组合考察p53提高了筛查的灵敏度；将γ-h2ax与p-h3组合可有效区分作用模式不同的基因毒性化合物，表明γ-h2ax、p-h3、p53和rad51高内涵组合分析盘检测复杂食品基质中的基因毒性物质准确度高，灵敏度强且可区分作用模式不同的基因毒性化合物。

25、本发明具有以下有益效果：

26、针对目前常用体外食品中基因毒性评价方法的局限性，本发明将人源化体外培养细胞株用于基因毒性评价，选用关联不同dna损伤修复途径的生物标志物γ-h2ax、p-h3、p53和rad51构建组合分析盘，考察复杂食品基质对组合分析盘检测结果的影响，结果发现可建立基于高内涵组合分析盘的复杂食品基质中的基因毒性物质的筛查检测方法，该方法灵敏度和特异性好，可有效区分复杂食品基质中的作用机制不同的基因毒性物质，从而为复杂食品基质中的基因毒性物质筛查检测提供了一种新方法。