猕猴桃抗病基因AcSPL2在溃疡病防治中的应用

本发明涉及基因工程，尤其涉及猕猴桃抗病基因acspl2在溃疡病防治中的应用。

背景技术：

1、猕猴桃是世界重要的特色水果，其富含维生素c和膳食纤维，营养丰富及经济价值高。目前猕猴桃大面积的种植栽培、育种及生产分布于世界5大洲23个国家以及地区，已经跻身于世界主流消费水果之列。

2、革兰氏阴性细菌病原丁香假单胞菌作为植物的十大病原菌之一，在模式作物拟南芥中主要危害植物植株的叶片。猕猴桃溃疡病(kiwifruit bacterial canker)作为丁香假单胞菌猕猴桃变种(pseudomonas syringae pv.actinidiae，psa)，是引起猕猴桃果树毁灭性的病害。该病自1984年在日本首次发现，后在全世界数十个国家中出现并造成了极大几近毁园般的危害。前期科学研究调查发现猕猴桃溃疡病在田间发病的主要体现在：位于猕猴桃地上部分的枝干、主蔓、叶茎干、花蕾以及叶片等位置，发病时会出现树体树干处流脓、类似于灼烧状态的叶斑以及花蕾腐烂溃疡；对于猕猴桃溃疡病菌在自然界中侵染猕猴桃植株时通常早期发现多在叶片上，一般表现为新生叶片上呈现渐变色褪绿小点，有水渍状，肉眼观察会发现明显的褪绿痕迹，一般在长期的低温高湿的环境下易于病菌的生长发育，病斑扩展较快。

3、gfp标记示踪-扫描电镜/透射电镜观察发现猕猴桃溃疡病多发生于植株叶片处，通过气孔或伤口入侵叶片并快速繁殖，随后病菌穿过猕猴桃细胞壁进入叶脉和叶柄导管，最终迁至嫩梢和枝干，进而整株猕猴桃受病菌侵扰，最后整株死亡(gao et al.2016)，严重时甚至整个果园都会受溃疡病菌侵害(guo et al.2020)。

4、现阶段为应对猕猴桃溃疡病的侵扰，在建园时一般选用抗病品种，接穗和砧木等都要经过消毒处理才可进入苗圃，接穗要从无感病母树上采集，嫁接时首先要用酒精或甲醛对使用的工具进行消毒，嫁接口要涂药保护(he et al.2023)；且要改善土壤结构，培养健壮树体，主要对有机肥、生物菌肥以及中微量元素肥要合理分配施用，并根据立地条件、树龄大小、树势强弱，对挂果量进行限制；同时春季可选用波尔多液、乙蒜素和四霉素等涂抹枝干防治猕猴桃溃疡病，后期可喷施乙蒜素或氢氧化铜等多种药剂防治叶片病害(jianget al.2022；hu et al.2020)，而以链霉素、四环素和春雷霉素等抗生素类、硫酸铜等铜制剂类和噻霉酮是目前猕猴桃溃疡病最有效的防治药剂，但抗药性及病菌可侵入猕猴桃枝干木质部等问题造成一旦侵染，药剂很难防控(colombi et al.2017)。

5、植物在反应抵抗外来侵入的微生物“入侵者”过程中一般也有自己的感知来识别“非我”的分子机制。植物首选的策略是基于胞外模式识别跨膜受体(pattern recognitionreceptors，prrs)来识别病原体相关的保守分子(pathogen-associated molecularpattern，pamps)以用于激活自身防御系统，产生一种葡萄糖高分子物质——胼胝质的沉积以加强植物体的细胞壁来阻止外来病原菌的入侵，防止大多数微生物病原体在宿主上增殖，这个过程在植物抗病免疫系统中发挥着十分重要的作用，因此被称为病原物相关分子模式触发免疫(pamp-triggered immunity，pti)。尽管植物体中pti途径可以成功阻挡大部分的病原体侵入植物体，但是物竞天择，有小部分的病原微生物会相应进化以此来突破植物体的pti途径，最终向植物宿主体内注入毒性因子(virulence factors)或称为效应因子(effector molecules)来抑制植物体中应该产生的pti途径。病原菌的效应因子在成功抑制pti途径后，一些毒效应因子在寄主植物造成干扰，植物体会启动第二套策略进行低抗外来入侵的微生物，其定位在植物细胞内的抗性(r)蛋白会相应感知并进行触发免疫，又称效应因子触发免疫(effector-triggered immunity，eti)。

6、在病菌侵染宿主过程中，丁香假单胞菌很少直接穿过细胞壁侵入细胞内部，多数生活在各种植物器官的细胞间隙或者维管组织，病菌依赖iii型分泌系统(type iiisecretion system，t3ss)将一些t3es分泌到植物细胞内，bundalovic-torma等通过抑制宿主免疫或干扰宿主正常生理功能等方式来促进侵染。这些t3es与宿主细胞互作，克服宿主的免疫反应或干扰宿主正常的生理过程，包括靶向抑制mapk信号级联、prr复合物、pti转录调节因子、eti信号分子等，使得病菌能够定殖、繁殖和致病。此外，ngou等证明了t3es还可以靶向植物蛋白酶体(proteasome)、细胞骨架和分泌系统，从而间接影响植物免疫反应。mccann等对不同类型psa群体的基因组t3es编码基因进行比较，共发现51个效应子编码基因。有17个效应子在biovar 1-4生物型中表现保守，包括编码在保守效应子区(conservedeffector locus，cel)的avre1、hopm1、hopaa1和hopn1。在模式病原p.syringae pv.tomatodc3000(pst dc3000)和拟南芥的互作研究中，jayaraman等证实hopm1(以下标记为hopm1pst)和avre1存在功能冗余，它们能够诱导植物叶片水渍(water-soaking)现象的产生，从而促进病菌在拟南芥质外体(apoplast)中获取水分，最终促进病原物繁殖和病害发生(xin et al 2016；roussin-léveillée et al 2022；hu et al 2022)。在拟南芥中，hopm1pst定位于反面高尔基体，它会触发蛋白酶体对atmin7的降解从而抑制植物pti和eti的免疫反应(nomura et al 2006；nomura et al 2011；lozano-durán et al 2014)，而psa中的同源基因hopm1psa(以下标记为hopm1psa)与hopm1pst氨基酸序列同源性为66.9％，它则定位于叶绿体(choi et al 2017)，暗示它们的功能存在差异性。等在2016年使用生化实验表明hopm1pst可以与多种e3泛素连接酶(upl1和upl3)和蛋白酶体亚基互作。张晋龙等通过对psa强毒株系与弱毒株系中31个百分百同源性的效应蛋白选取进行缺失突变，发现hopm1psa是psa内重要的毒性因子，敲除后会致使psa的致病力下降。

7、在蛋白质泛素化过程中有3个关键酶类参与底物蛋白的泛素化，即泛素活化酶e1(ubiquitin-activating enzyme)，泛素合酶e2(ubiquitin-conjugating enzyme)和泛素连接酶e3(ubiquitin ligase)，其中e3泛素连接酶是泛素化途径中种类最丰富的一类酶，其主要的功能是负责识别底物特异性，通常可以将目的蛋白质多泛素化后被蛋白酶体所识别进而被降解；也是调节生物体响应逆境胁迫耐受的重要酶类(zhang and zeng 2020；maet al 2021；sun et al 2022)。e3泛素连接酶在植物中由于作为降解途径中的一类基因，在植物生命周期中起着关键作用，而其根据亚基的结构不同分为单亚基型与多亚基型两大类，现阶段主要5研究的多为单亚基型，前者又可分为hect(homologous to e6-associatedprotein coterminus)结构域家族、ring(really interesting new gene)结构域家族和u-box结构域家族；常见的多亚基是crl复合体(cullin-ring ligase)如scf(skpl，cullin，f-box)类型连接酶。目前，在拟南芥已经报道的1400个e3泛素连接酶中，ring结构域的e3泛素连接酶可以结合两个锌离子(zn2+)，因其蛋白的典型特征，ring型e3连接酶作为桥梁将活化的泛素从e2转移到底物蛋白上，本身不与泛素分子发生结合。不同类别的e3泛素连接酶家族成员都先后被报道参与植物免疫反应过程。比如，杨玖霞等通过细胞膜上的模式识别分子(prr)调控植物对病原分子相关分子模式的识别，并调节细胞内的核苷酸绑定亮氨酸富集的免疫受体积累；另外研究表明e3泛素连接酶还以一些核转录因子或囊泡运输的成分来作为靶蛋白进而调控因病原菌识别后导致的下游免疫反应的各种信号途径。早期在2003年有kubori t等研究表明，e3泛素连接酶可直接作用于病原物无毒基因(avr)和植物抗病基因(r蛋白基因)，e3泛素连接酶将它们泛素化并经26s蛋白酶降解体系最终降解，从而达到对寄主r基因所介导的eti抗病反应的调控，同时提出e3泛素连接酶可以通过调节植物过敏反应(hypersensitive response，hr)以达到对eti过程的调节；例如，拟南芥中的nlr(lz-nbslrr)抗性蛋白rpm1被发现接种丁香假单胞菌后聚集在质膜附近，但在hr反应初期迅速消失，boyes d c等早期就已经发现ring型内ring2和ring3能够与rpm1蛋白相互作用，这从一方面印证了在rpm1介导的植物eti抗病信号途径中，是存在泛素蛋白酶体降解途径。泛素化修饰(ubiquitination)在调控植物抗病应答过程中的重要性越来越被重视(withers and dong 2017；zhou and zeng 2017；chen et al 2022；tang et al 2022)，相关研究主要集中于e3泛素连接酶和底物蛋白泛素化后被26s蛋白酶体降解。此外，部分病菌的效应蛋白，lei等在近年证实了如丁香假单胞菌avrptob，直接或间接参与宿主细胞泛素化途径。目前，已在数十个种的植物(如水稻)中发现ring型e3泛素连接酶通过正向或者负向调节植物免疫过程(wang et al 2006；liu et al 2015；ma et al 2021)。fu等从水稻中筛选到一个与微管相关的新型c4hc3型e3泛素连接酶mel。研究发现mel通过识别并降解植物光呼吸通路中的核心因子丝氨酸羟甲基转移酶1(shmt1)激发植物免疫信号，包括诱导线粒体ros积累、激活mapk通路以及诱导病程相关基因上调表达，赋予水稻对条纹叶枯病、稻瘟病及白叶枯病的广谱抗病性。相比而言，ring型e3泛素连接酶在果树抗病的功能研究比较匮乏，尚未开展在猕猴桃中的相关研究。

技术实现思路

1、本发明提供一种猕猴桃抗病基因acspl2在猕猴桃溃疡病防治中的应用，解决针对猕猴桃溃疡病，现有防治手段防治效率低、抗药性等问题。

2、本发明提供acspl2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料；所述蛋白acspl2的氨基酸序列为如下任一种：

3、(1)seq id no.1所示的氨基酸序列；

4、(2)seq id no.1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的蛋白质。

5、优选的，所述蛋白acspl2的编码基因的核苷酸序列为如下任一种：

6、(1)seq id no.2所示的核苷酸序列；

7、(2)seq id no.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

8、(3)在严格条件下可以与seq id no.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

9、本发明提供acspl2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控植物病害抗性中的应用。

10、本发明提供acspl2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在防治植物病害中的应用。

11、根据所述应用，所述植物病害为植物溃疡病。

12、优选为猕猴桃溃疡病。

13、acspl2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在以下任一项或几项中的应用；

14、1)提高植物体内黄酮及类黄酮物质的含量；

15、优选的，所述黄酮物质包括飞燕草素；

16、2)促进植物叶片黄化；

17、3)使植物的茎干与叶边缘提前红化。

18、本发明提供acspl2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控蛋白hopm1psa中的应用；

19、所述蛋白hopm1psa的氨基酸序列为如下任一种：

20、(1)seq id no.3所示的氨基酸序列；

21、(2)seq id no.3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的蛋白质。

22、优选的，所述蛋白hopm1psa的编码基因的核苷酸序列为如下任一种：

23、(1)seq id no.4所示的核苷酸序列；

24、(2)seq id no.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

25、(3)在严格条件下可以与seq id no.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

26、根据所述应用，acspl2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料通过抑制hopm1psa蛋白的编码基因的表达量提高植物病害抗性。

27、本发明提供acspl2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

28、优选的，在猕猴桃抗溃疡病育种中的应用。

29、根据所述应用，所述蛋白acspl2的氨基酸序列为如下任一种：

30、(1)seq id no.1所示的氨基酸序列；

31、(2)seq id no.1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的蛋白质。

32、优选的，所述蛋白acspl2的编码基因的核苷酸序列为如下任一种：

33、(1)seq id no.2所示的核苷酸序列；

34、(2)seq id no.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

35、(3)在严格条件下可以与seq id no.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

36、根据所述应用，所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

37、本发明提供构建抗溃疡病的转基因猕猴桃的方法，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使猕猴桃表达或过表达acspl2基因。

38、优选的，所述转基因包括利用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导或基因编辑技术的方法将包含acspl2基因的重组表达载体导入猕猴桃，获得转基因猕猴桃株系。

39、根据所述应用，所述植物为猕猴桃科植物。

40、优选的，所述植物为猕猴桃属植物。

41、进一步优选的，所述植物为猕猴桃。

42、本发明的有益效果：

43、本发明基因acspl2对猕猴桃溃疡病病菌发病具有显著抑制作用，对猕猴桃抗病育种提供新的思路。本发明通过基因组和转录组数据，成功获得猕猴桃acspl2序列、组培苗及土培苗，为后续的工作奠定了基础。