一种鼻疽杆菌重组蛋白、试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种鼻疽杆菌重组蛋白、试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、马鼻疽(glanders)是由鼻疽杆菌引起的马、骡、驴等单蹄动物的一种高度接触性的致死性传染病，人也可感染。鼻疽病马以及患鼻疽的其它动物均为本病的传染源。病菌随鼻涕、皮肤的溃疡分泌物等排出体外，污染用具、草料、饮水、厩舍等。通过同槽饲养、同桶饮水、互相啃咬等经消化道感染，驴、骡最易感。人和多种温血动物都对本病易感。反刍动物中的牛、山羊、绵羊人工接种也可发病，但狼、狗、绵羊和山羊偶尔也会自然感染本病。捕获的野生狮、虎、豹、豺和北极熊因吃病畜肉也得此病而死亡。本病一年四季均可发生，潜伏期为6个月。临床上常分为急性型和慢性型，急性型发病较为严重可致死。

2、我国已于2004年消灭马鼻疽，但亚洲和南美洲仍有马鼻疽疫情发生，存在传入我国的风险。对马的管理是控制马鼻疽疫情的关键。因此，研究有效的快速简便适于现场使用的鼻疽杆菌感染的方法对控制该疫情具有重要意义。

3、鼻疽杆菌常用的检验方法包括病原分离鉴定、聚合酶链式反应、鼻疽菌素试验和血清学检验。开放性鼻疽的诊断以临床检查为主，病变不典型的，则须进行鼻疽菌素点眼试验或血清学试验。但检疫方法的时间长，且受人为因素的影响较大。胶体金方法操作简单，时间短，结果较准确，且受人为因素干扰少，适合用于大规模的检测，胶体金方法中抗原最为重要，影响着检测结果的准确性，因此，亟待开发出适用于特异检测的抗原。

技术实现思路

1、为了解决上述问题中的至少一个问题，本发明提供了一种鼻疽杆菌重组蛋白、试剂盒及其制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种鼻疽杆菌重组蛋白，包括seq id no.5或seq id no.7所示氨基酸序列。

4、在本发明的一些具体实施方案中，一种鼻疽杆菌重组蛋白，由seq id no.5或seqid no.7所示氨基酸序列组成。

5、在本发明中，所述的重组蛋白、融合蛋白、重组融合蛋白和融合重组蛋白具有相同的含义，均是指通过dna重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。

6、可以看出，第一方面所述的鼻疽杆菌重组蛋白由包括seq id no. 1所示氨基酸序列的0375h蛋白和包括seq id no. 3所示氨基酸序列的tssb蛋白片段中间用gsgsg（seq idno. 9）连接重组而成。其中，编码氨基酸序列如seq id no. 1所示的0375h蛋白的基因根据ncbi gene bank aau46487.1的蛋白序列设计的，其核苷酸序列如seq id no. 2所示；编码氨基酸序列如seq id no. 3所示的tssb蛋白的基因其核苷酸序列如seq id no. 4所示；本发明将0375h全长蛋白和tssb蛋白部分片段融合在一起表达，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应。

7、在本发明的一些具体实施方案中，优选地，鼻疽杆菌重组蛋白由seq id no. 5所示氨基酸序列组成，在检测鼻疽杆菌抗体时，具有优异的灵敏性和特异性。

8、本发明的第二方面提供了一种编码第一方面所述的重组蛋白的基因，包括seq idno.6或seq id no.8所述核苷酸序列。其中，包括seq id no. 6所示核苷酸序列的基因编码包括seq id no. 5所示氨基酸序列的鼻疽杆菌重组蛋白；包括seq id no. 8所示核苷酸序列的基因编码包括seq id no. 7所示氨基酸序列的鼻疽杆菌重组蛋白。

9、该基因序列是为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mrna有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达，可以提高蛋白表达效率。

10、本发明的第三方面提供了一种表达载体，包括第二方面所述基因。在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为pet30a，其具有卡那霉素抗性，表达的融合蛋白具有组氨酸（his）标签。

11、本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，含有第三方面所述表达载体。在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为bl21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、成本低、表达量大等优点。

12、本发明的第五方面提供了第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测鼻疽杆菌抗体的试剂盒中的应用。

13、本发明的第六方面提供了一种用于检测鼻疽杆菌抗体的试剂盒，包含第一方面所述的重组蛋白。在一些具体实施方案中，试剂盒还包括r-spa、streptavidin以及bsa-biotin。

14、在一些具体实施方案中，用于检测鼻疽杆菌抗体的试剂盒包括用于检测鼻疽杆菌抗体的试纸条。

15、试纸条检测是采用近年兴起并快速发展的一种新型分析技术---胶体金标记免疫分析法进行的，其特点是快捷简便、成本低、无污染且无需培训，与传统方法相比更为适合现场检测。与传统方法相比，具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。

16、本发明第七方面提供了一种用于检测鼻疽杆菌抗体的试纸条，所述试纸条的制备方法包括如下步骤：

17、（1）在三角烧瓶中加入一定体积的超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10%氯金酸和10%柠檬酸三钠溶液，继续加热沸腾，冷却至室温后用0.22μm过滤器过滤胶体金，得到胶体金溶液1，放置4℃备用；在本发明的一些具体实施方案中，超纯水的去量为1000ml，10%氯金酸4ml，10%柠檬酸三钠溶液4.8ml，加热沸腾5min；

18、（2）向冷却后的胶体金溶液1中加入0.2m k2co3调节至ph 8.0，加入r-spa，搅拌后加入10g/l：10g/l的tris-casein溶液，再次搅拌后11000rpm离心15-25min，将沉淀用金标稀释液重悬，得到胶体金溶液2；

19、（3）向冷却后的胶体金溶液1中加入0.2m k2co3调节至ph7.0，加入streptavidin，搅拌后加入40g/l：40g/l的tris-casein溶液，再次搅拌后11000rpm离心15-25min，将沉淀用金标稀释液重悬，得到胶体金溶液3；在本发明的一些具体实施方案中，搅拌步骤中搅拌时间为15min。

20、（4）将胶体金溶液2和胶体金溶液3混合后浸泡玻璃纤维，烘干后得到金标垫；

21、（5）用稀释液将第一方面所述的重组蛋白稀释至0.5mg/ml，制成检测线溶液，用相同稀释液稀释bsa-biotin至2.0mg/ml，制成控制线溶液，用检测线溶液和控制线溶液在硝酸纤维素膜上划出c线和t线，37℃烘干；

22、（6）将以上金标垫、包被好的硝酸纤维素膜及滤纸、样品垫、卡壳等组装成胶体金检测试剂条。

23、在一些具体实施方案中，所述制备步骤（3）中金标稀释液为tris 2.5g/l，casein2.5g/l，0.03% proclin300的溶液。

24、在本发明一些具体实施方案中，所述制备步骤（5）中稀释液为10mm pbs，2%蔗糖，ph=7.4的溶液。

25、在本发明的一些具体实施方案中，试纸条在使用时，滴加马生物样本至样本垫处，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下：

26、①仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；

27、②有两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；

28、③质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，应当更换新试纸条重新测试。

29、在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为血清或血浆，或任何其他可能包含抗体的体液。

30、本发明的有益效果

31、本发明具有以下有益效果为：本发明的鼻疽杆菌重组蛋白在大肠杆菌表达系统中得到，具有生产周期短，产量高，成本低，特异性好的优点。以重组融合蛋白可作为鼻疽杆菌胶体金检测试剂盒的一部分，敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为常规检测手段。本发明方法方便快捷，能在较短的时间内检测出生物样本中是否含有鼻疽杆菌抗体，且不需要昂贵的仪器设备。本发明对于鼻疽杆菌感染的诊断与临床用药具有较高的参考价值，适于推广应用。