一种蒺藜苜蓿多心皮蛋白及其编码基因与应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种蒺藜苜蓿多心皮蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

1、植物丰富的生物学多样性体现在花器官形态的多样性上。花是被子植物特有的繁殖器官，花器官的正常发育是植物个体发育的重要环节，也是繁衍后代的关键。虽然植物花器官千姿百态，但其结构组成特异性很强，一般由花萼、花瓣、雄蕊和心皮构成。心皮作为被子植物雌性器官发育的关键，为雌雄配子体的发育及受精后形成果实提供了重要场所，对产量性状的建成具有重要作用，因此，研究心皮发育过程对于作物高产优质育种具有重要意义。

2、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)属于豆科蝶形花亚科，其花为典型的两侧对称蝶形花。在蒺藜苜蓿的突变体库中，有多种类型的花器官突变体，有些突变体的花器官数目异常，比如花瓣、雄蕊、心皮等结构丢失、减少或增加；有些突变体的花器官发育不完全，比如花粉囊无法打开、花粉不成熟、心皮结构不完全等，导致无法受精结实。在过去的研究中,已经鉴定出许多基因组成了复杂的调控网络，参与花分生组织的特化及花器官原基的形成。根据花器官发育的“abcde”模型，花器官的特化需要不同类型基因的协调完成。豆科植物花序和花发育中关键调控基因的功能研究对于更好地理解它们在进化过程中的作用至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种与植物心皮数量相关的蛋白质及其应用。

2、第一方面，本发明保护一种与植物心皮数量相关的蛋白质，该蛋白质的名称为pcp，所述pcp蛋白质为如下(a1)-(a4)任一所述的蛋白质：

3、(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；

4、(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；

5、(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物心皮数量相关的蛋白质；

6、(a4)来源于苜蓿且与(a1)具有98％以上同一性且与植物心皮数量相关的蛋白质。

7、上述(a2)所述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

8、上述(a3)所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

9、上述(a4)所述蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

10、上述(a1)-(a4)任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

11、第二方面，本发明保护编码pcp蛋白质的核酸分子。

12、所述核酸分子为如下(b1)或(b2)所述的dna分子：

13、(b1)序列表中序列1或序列3所示的dna分子；

14、(b2)来源于苜蓿且与(b1)具有75％以上同一性且编码所述pcp蛋白质的dna分子。

15、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码pcp蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的pcp核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码pcp蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

16、这里使用的术语“同一性”是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

17、第三方面，本发明保护含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

18、所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达pcp蛋白质的dna，该dna不但可包括启动pcp转录的启动子，还可包括终止pcp转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。

19、所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为含有序列1所示的用于编码pcp蛋白质的dna分子的载体。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

20、所述重组微生物可为含有上述核酸分子或上述表达盒或上述重组载体的酵母、细菌、藻和真菌。

21、第四方面，本发明保护上述pcp蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体或重组微生物的新用途。

22、本发明保护上述pcp蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体或重组微生物在调控植物心皮数量中的应用。

23、第五方面，本发明保护抑制上述pcp蛋白质的物质的新用途。

24、本发明保护抑制上述pcp蛋白质的物质在提高植物心皮数量或培育心皮数量增多的转基因植物中的应用。

25、所述抑制上述pcp蛋白质的物质可为抑制或降低植物中pcp蛋白质活性和/或含量的物质。

26、进一步的，所述抑制或降低植物中pcp蛋白质活性和/或含量的物质可为抑制上述pcp蛋白质活性的物质或抑制编码上述pcp蛋白质基因表达的物质或敲除编码上述pcp蛋白质基因的物质。

27、所述抑制上述pcp蛋白质活性的物质可为任何能够使植物中上述pcp蛋白质活性缺失的物质，如抑制上述pcp蛋白质合成或促进上述pcp蛋白质降解或抑制上述pcp蛋白质功能的蛋白质、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制剂)。

28、所述抑制编码上述pcp蛋白质基因表达的物质可为任何能够使植物中编码上述pcp蛋白质的基因无法表达的物质，如沉默植物中编码上述pcp蛋白质基因的物质(如mirna、sirna、dsrna、shrna等)。

29、所述敲除编码上述pcp蛋白质基因的物质可为以任何方式实现宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分(例如启动子编辑)使得编码基因序列不被转录、通过与mrna的结合阻止翻译等。通常，敲除在基因组dna水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。

30、进一步的，所述敲除编码上述pcp蛋白质基因的物质可为任何能够使植物中编码上述pcp蛋白质的基因发生突变(所述突变形式可为缺失突变和/或插入突变和/或碱基替换)从而失去活性的物质，如锌指蛋白zfn基因编辑系统或talens基因编辑系统或crispr/cas9基因编辑系统或生物诱变系统等。

31、更进一步的，所述生物诱变系统可为用于t-dna插入的物质、用于转座子插入的物质或用于反转录子插入的物质。

32、在本发明的一个具体实施例中，所述用于反转录子插入的物质为用于tnt1反转录子插入的物质。

33、第六方面，本发明保护一种培育心皮数量增多的转基因植物的方法。

34、本发明保护的培育心皮数量增多的转基因植物的方法包括降低受体植物中pcp蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的心皮数量高于所述受体植物。

35、进一步的，所述降低受体植物中pcp蛋白质的含量和/或活性的方法包括将上述降低pcp蛋白质的含量和/或活性的物质导入受体植物。

36、更进一步的，所述降低pcp蛋白质的含量和/或活性的物质为用于tnt1反转录子插入的物质。

37、在本发明的一个具体实施例中，所述转基因植物为pcp-1纯合突变体或pcp-2纯合突变体或pcp-2纯合突变体。

38、所述pcp-1纯合突变体与野生型蒺藜苜蓿r108基因组序列的差别仅在于在pcp基因的基因组序列(序列3)的第251位和第252位之间插入tnt1序列，所述tnt1序列如序列表中序列4所示。

39、所述pcp-2纯合突变体与野生型蒺藜苜蓿r108基因组序列的差别仅在于在pcp基因的基因组序列(序列3)的第656位和第657位之间插入tnt1序列，所述tnt1序列如序列表中序列4所示。

40、所述pcp-3纯合突变体与野生型蒺藜苜蓿r108基因组序列的差别仅在于在pcp基因的基因组序列(序列3)的第759位和第760位之间插入tnt1序列，所述tnt1序列如序列表中序列4所示。

41、第七方面，本发明提供了一种转基因植物的制备方法。

42、本发明提供的转基因植物的制备方法可为如下c1)-c3)中任一种：

43、c1)将受体植物中序列3所示dna分子替换为dna分子甲，得到转基因植物；所述转基因植物的心皮数量高于所述受体植物；所述dna分子甲为在序列3第251位和第252位之间插入序列4所示的dna分子后得到的dna分子；

44、c2)将受体植物中序列3所示dna分子替换为dna分子乙，得到转基因植物；所述转基因植物的心皮数量高于所述受体植物；所述dna分子乙为在序列3第656位和第657位之间插入序列4所示的dna分子后得到的dna分子；

45、c3)将受体植物中序列3所示dna分子替换为dna分子丙，得到转基因植物；所述转基因植物的心皮数量高于所述受体植物；所述dna分子丙为在序列3第759位和第760位之间插入序列4所示的dna分子后得到的dna分子。

46、上述任一所述替换均为纯合型替换，即同源染色体中发生相同的替换。

47、上述任一所述应用或方法中，所述植物为如下d1)-d5)中的任一种：

48、d1)单子叶植物；

49、d2)双子叶植物；

50、d3)豆科植物；

51、d4)苜蓿；

52、d5)蒺藜苜蓿。

53、本发明从蒺藜苜蓿tnt1插入突变体库中找到一个心皮增多的tnt1插入突变体，经过侧翼序列分析克隆出该心皮增多表型的控制基因pcp。为了证明pcp为多心皮的控制基因，在突变体库中反筛了pcp基因的另外两个插入突变体，发现这两个突变体出现与之前突变体完全相同的表型。以上结果证明本发明中的pcp基因确实可调控植物心皮数量。本发明对于花器官发育与进化的研究以及高产优质作物的培育具有重要意义。