胰岛素-Fc融合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及多肽类药物领域，尤其涉及一种在经过位点特异性蛋白酶切割后具有增强的胰岛素活性和延长的体内半衰期的胰岛素-fc融合蛋白、其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，糖尿病的发病率呈逐年升高趋势，1型糖尿病主要依赖外源性的胰岛素控制血糖；2型糖尿病随着病情的恶化发展，胰岛素也成为其控制血糖的主要药物。因此，利用胰岛素治疗糖尿病已成为较有效的方式。

2、胰岛素疗法对于具有异常胰岛素分泌(i型)或胰岛素抗性(ii型)的患者是必需的，而且通过胰岛素施用能正常调节血液葡萄糖水平。然而，像其它蛋白质和肽激素一样，胰岛素具有很短的体内半衰期，因而具有反复施用的缺点。此类频繁施用对患者引起严重的疼痛和不适。出于这个原因，为了通过延长蛋白质的体内半衰期及降低施用频率来改善生活质量，已经对蛋白质配制剂和化学缀合(脂肪酸缀合物，聚乙烯聚合物缀合物)进行了许多研究。商品化的长效胰岛素包括由sanofi aventis制造的甘精胰岛素(lantus，持续约20小时至22小时)，和由novo nordisk制造的地特胰岛素(levemir，持续约18小时至22小时)和tresiba(德谷胰岛素，持续约40小时)。这些长效胰岛素配制剂不产生血液胰岛素浓度峰，因而它们适合作为基础胰岛素。然而，因为这些配制剂不具有足够长的半衰期，所以仍然存在每天或者两到三天注射一次的缺点。因而，在实现每周一次给药频率，以改善需要长期施用胰岛素的糖尿病患者的便利性的预定目标方面存在限制。

3、专利公开cn103509118b中公开了一种与抗体fc区融合的单链胰岛素，虽然体外实验中证明该胰岛素-fc融合蛋白具有改善的半衰期，但是该融合胰岛素的体内降糖活性较低，不适于作为临床施用。

4、控制血糖病症的成功性与要治疗的患者的依从性高度相关，并且期望降低所需的注射频率。然而，现有的这些经修饰的胰岛素分子要么活性很低，不适于临床使用；要么活性很高，施用于患者后有快速降糖效应，导致低血糖的副作用。因此本领域迫切需要一种适合于临床施用的新型长效胰岛素。

技术实现思路

1、经过大量研究，发明人提供了一种胰岛素-fc融合蛋白，该融合蛋白经过位点特异性蛋白酶切割后获得增强的胰岛素活性和延长的体内半衰期，并且令人惊奇地发现，所述融合蛋白的体内降血糖效应更为平坦和稳定，能够提高临床用药的安全性和患者依从性，从而更好地实现血糖管理并提供更好的生活质量。

2、在一个方面，本发明提供一种胰岛素-fc融合蛋白，其经过位点特异性蛋白酶切割后具有增强的胰岛素活性和延长的体内半衰期，其具有式(i)的结构：

3、x-e1-y-e2-z-l-fc   (i)，

4、其中，

5、x和z分别是胰岛素的b链和a链，并且如果x是b链，则z是a链；如果x是a链，则z是b链。

6、y为任选的连接肽；y的长度可以为1-100个或更多个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100个或以上任意两个数值之间的值；例如y为胰岛素c肽或者其变体或片段。

7、e1和e2中的一个存在或两个都存在，是包含位点特异性蛋白酶切割位点的一段氨基酸；e1和e2的长度可以是1-10个或更多个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸；如果同时存在，e1和e2可被相同或不同的位点特异性蛋白酶切割，例如可被相同的位点特异性蛋白酶切割；如果y存在，则优选地e1和e2两个都存在；如果y不存在，则优选地e1和e2中存在一个；所述位点特异性蛋白酶切割位点可以是kex2和/或弗林(furin)蛋白酶的切割位点，例如是kex2蛋白酶的切割位点。

8、l为连接z与fc的接头(linker)；l可以是多肽片段，例如，l包含选自ala、thr、gly和ser中一个、两个或更多个氨基酸的柔性单元(本文中也称柔性肽段)，更例如一段由g和s构成的柔性单元；l也可以是包含刚性单元(本文中也称刚性肽段)的多肽片段。

9、在一些实施方案中，所述刚性单元包含或主要由刚性氨基酸构成，所述刚性氨基酸包括但不限于v、p、i、k和l。

10、在一些实施例中，所述刚性单元包含一个或更多个pppx1lp(seq id no:125)，其中x1为任意氨基酸；

11、在另一些实施例中，所述刚性单元包含一个或更多个x2apppx1lp(seq id no:126)，其中x1为任意氨基酸，x2为k或v。

12、在另一些实施例中，所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：

13、pppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:127)；

14、pppalpapvrlpgp(seq id no:128)；和

15、pppalpavapppalp(seq id no:129)。

16、在另一些实施例中，所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：

17、kapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:130)；

18、vapppalpapvrlpgp(seq id no:131)；和

19、vapppalpavapppalp(seq id no:132)。

20、在一些实施方案中，l既包含刚性单元，也包含柔性单元，可以是多于两个单元。

21、fc是免疫球蛋白的fc区；所述fc可以来自人免疫球蛋白；所述fc区可以是来自igg、iga、igd、ige或igm的fc区；优选地，所述fc区是来自igg的fc区，例如来自igg1、igg2、igg3或igg4的fc区；再优选地，所述fc区是来自igg2的fc区；其中与其来源序列相比，所述fc区可以带有一个或更多个替换、添加和/或缺失，同时仍保留延长半衰期的能力，例如来自人igg的fc区并带有降低或消除与fcγr结合的突变和/或增强与fcrn结合的一个或更多个突变，所述突变可以选自：n297a、g236r/l328r、l234a/l235a、n434a、m252y/s254t/t256e、m428l/n434s、t250r/m428l；所述fc区可以是糖基化的或未糖基化的。

22、在一些实施方案中，对于本发明的融合蛋白来说，所述胰岛素选自人胰岛素、牛胰岛素或猪胰岛素，优选地是人胰岛素；例如所述胰岛素的a链和b链源自人胰岛素。

23、在一些实施例中，y、e1和e2都存在，或者其中y不存在，e1和e2中存在一个。

24、在另一些实施例中，所述融合蛋白具有选自seq id no:47-72的氨基酸序列。

25、在第二个方面中，本发明提供一种胰岛素-fc融合蛋白，其具有ins-l-fc结构。在一些实施方案中，本发明第一个方面的融合蛋白在特异性蛋白酶的作用下，可以去除c链，产生本发明第二个方面所述的融合蛋白。在一些实施方案中，所述胰岛素-fc融合蛋白以同源二聚体的形式存在，其结构示意图如图3所示。在一些实施方案中，所述胰岛素-fc融合蛋白具有与天然胰岛素类似的二级及三级结构。

26、其中，ins是提供胰岛素活性的胰岛素部分，其包括通过共价键连接的胰岛素a链和b链，但a链和b链位于不同的肽链中；所述共价键优选地是二硫键。

27、l为连接z与fc的接头；l可以是多肽片段(在本文一些实施方案中也可称为连接肽)，例如，l包含选自ala、thr、gly和ser中一个、两个或更多个氨基酸的柔性单元；l还可以是包含刚性单元的多肽片段。

28、在一些实施例中，所述l包含一个或更多个刚性单元，所述刚性单元包含或主要由刚性氨基酸构成，所述刚性氨基酸包括但不限于v、p、i、k和l。

29、在另一些实施例中，所述刚性单元包含一个或更多个pppx1lp(seq id no:125)，其中x1为任意氨基酸。

30、在另一些实施例中，所述刚性单元包含一个或更多个x2apppx1lp(seq id no:126)，其中x1为任意氨基酸，x2为k或v。

31、在另一些实施例中，所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：

32、pppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:127)；

33、pppalpapvrlpgp(seq id no:128)；和

34、pppalpavapppalp(seq id no:129)。

35、在另一些实施例中，所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：

36、kapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:130)；

37、vapppalpapvrlpgp(seq id no:131)；和

38、vapppalpavapppalp(seq id no:132)。

39、fc是免疫球蛋白的fc区；所述fc可以来自人免疫球蛋白；所述fc区可以是来自igg、iga、igd、ige或igm的fc区；优选地，所述fc区是来自igg的fc区，例如来自igg1、igg2、igg3或igg4的fc区；再优选地，所述fc区是来自igg2的fc区；其中与其来源序列相比，所述fc区可以带有一个或更多个替换、添加和/或缺失，同时仍保留延长半衰期的能力，例如来自人igg的fc区并带有降低或消除与fcγr结合的突变和/或增强与fcrn结合的一个或更多个突变，所述突变可以选自：n297a、g236r/l328r、l234a/l235a、n434a、m252y/s254t/t256e、m428l/n434s、t250r/m428l；所述fc区可以是糖基化的或未糖基化的。

40、在一些实施方案中，所述胰岛素选自人胰岛素、牛胰岛素或猪胰岛素，优选地是人胰岛素；例如所述胰岛素的a链和b链源自人胰岛素。

41、在另一些实施方案中，所述l包含ctp，例如包含1、2、3个或更多个ctp。

42、在第三个方面中，本发明提供一种生产具有增强胰岛素活性和延长半衰期的胰岛素-fc融合蛋白的方法，其包括将本发明第一方面中所述的融合蛋白与能切割所述位点的特异性蛋白酶接触，优选地所述位点特异性蛋白酶是kex2和/或弗林(furin)蛋白酶。

43、在一些实施方案中，本发明的具有增强胰岛素活性和延长体内半衰期的胰岛素-fc融合蛋白是由上述方法得到的。

44、在第四个方面中，本发明提供编码所述融合蛋白的多核苷酸，优选地所述多核苷酸是能表达所述融合蛋白的表达载体。

45、在第五个方面中，本发明提供能表达胰岛素-fc融合蛋白的细胞，其包含上述的多核苷酸。

46、在第六个方面中，本发明提供一种生产胰岛素-fc融合蛋白的方法，其包括在表达胰岛素-fc融合蛋白的条件下培养本发明第五个方面中所述的细胞；优选地还包括使所述胰岛素-fc融合蛋白与能切割所述位点的特异性蛋白酶相接触，其中所述培养步骤和接触酶切步骤可以同时进行或分开进行。所述方法还可包括蛋白纯化步骤，获得目的融合蛋白。

47、在第七个方面中，本发明提供能表征胰岛素-fc融合蛋白结构的方法，其包含融合蛋白脱糖分子量的检测和二硫键的表征。

48、在第八个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含以上第一和第三个方面中所述的融合蛋白、第四个方面中所述的多核苷酸或者第五个方面中所述的细胞。

49、在第九个方面中，本发明提供一种降低血糖和/或治疗糖尿病的方法，其包括将第一和第二个方面中所述的融合蛋白、第四个方面中所述的多核苷酸或者第五个方面中所述的细胞施予有此需要的对象，优选地所述糖尿病为i型或ii型糖尿病。此外，当施用本发明第一个方面中所述的融合蛋白时，还可以考虑额外施用适当的位点特异性蛋白酶，或者利用体内存在的适当的位点特异性蛋白酶。

50、对应于以上降低血糖和/或治疗糖尿病的方法，本发明还提供所述融合蛋白、多核苷酸或细胞在制备用于降低血糖和/或治疗糖尿病的药物中的用途。本发明还提供用于降低血糖和/或治疗糖尿病的融合蛋白、多核苷酸或细胞。