检测猫消化道病原体的多重PCR试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及猫消化道病原体检测，具体涉及检测猫消化道病原体的多重pcr试剂盒及应用。

背景技术：

1、猫细小病毒病（feline panleukopenia）又称猫泛白细胞减少症、猫瘟、猫传染性肠炎，是由猫细小病毒（ feline panleukopenia virus，fpv）引起的一种急性高度接触性传染病，病猫主要表现为机体内白细胞数量急剧减少，fpv还对猫科动物的消化道系统造成巨大伤害，病猫表现出严重的消化道症状。猫冠状病毒（ feline corona virus，fcv）是一种引起猫传染性腹膜炎的病毒，并不是所有的猫换上冠状病毒就一定会得猫传腹，一旦感染病毒，它们就会永远携带病毒，并通过唾液或粪便传染给其他猫；普通的猫冠状病毒通常仅会引起猫消化道疾病，但如果病毒变异后侵入其他器官，就会导致传染性腹膜炎的发生。猫传染性腹膜炎病毒（ feline infectious peritonitis，fip）猫传染性腹膜炎是由冠状病毒变异病毒引起的，5%~10%的冠状病毒患病猫会患上猫传腹。这种病毒可以在冠状病毒出现几周或几年后出现，而且几乎总是致命的。如今有441传腹药可针对性治疗，据说治愈概率95%以上。猫衣原体（chlamydia, c.felis）同样可以引起其消化道病变。

2、由于消化道病原种类繁多，易引起混合、并发或继发感染，造成相似的临床症状，难以区分和对症治疗。如何做到快速准确地鉴别病原，是实现精准治疗的前提。目前，胶体金快速诊断试纸是猫科动物临床诊断最常用的方法，但由于胶体金试纸敏感性较低，对早期感染或病原含量低的样品检出率低，不能满足临床高通量、准确的检测需求。因此，建立快速、准确的病原鉴别方法对猫科动物上消化道疾病的防治至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测猫消化道病原体的多重pcr试剂盒及检测方法，所述的这种检测猫消化道病原体的多重pcr试剂盒及检测方法要解决现有技术中的检测猫消化道病原体的方法灵敏度不高、成本较高、且不能同时检测猫消化道携带的多种病原体的技术问题。

2、本发明提供一种检测猫消化道病原体的多重pcr试剂盒，包括如下引物：

3、检测猫细小病毒的如seq id no.1~2所示的外引物对和如seq id no.3~4所示的内引物对；

4、检测猫肠道冠状病毒的如seq id no.6~7所示的外引物对和如seq id no.8~9所示的内引物对；

5、检测猫传染性腹膜炎病毒的如seq id no.11~12所示的外引物对和如seq idno.13~14所示的内引物对；

6、检测猫衣原体的如seq id no.16~17所示的外引物对和如seq id no.18~19所示的内引物对；

7、其中，如seq id no.1~2所示、如seq id no.6~7所示、如seq id no.11~12所示和如seq id no.16~17所示的外引物对的若干单核苷酸为锁核苷酸。

8、进一步地，所述试剂盒还包括如seq id no.5、10、15和20所示的探针。探针5’端连接有荧光基团fam，3’端连接有淬灭荧光基团tamra。

9、进一步地，所述试剂盒中还包括阳性标准品，所述阳性标准品包括分别携带：

10、如seq in no.21所示的猫细小病毒的特异性序列；

11、如seq in no.22所示的猫肠道冠状病毒的特异性序列；

12、如seq in no.23所示的猫传染性腹膜炎病毒的的特异性序列；

13、如seq in no.24所示的猫衣原体的特异性序列的四个重组质粒。

14、进一步地，所述多重pcr试剂盒可以配制成为一个多重pcr反应体系，所述多重pcr反应体系以100μl计包含：

15、50μl 2×pcr buffer；

16、5μl模板；

17、四种外引物对均为100nm，各2.5μl；

18、四种内引物对均为100nm，3μl；

19、余量为pcr所需的mg2+，dntp，taq dna聚合酶，及无核酸酶水。

20、进一步地，所述多重pcr试剂盒可以配制成为一个多重pcr反应体系，所述多重pcr反应体系以100μl计包含：

21、50μl 2×pcr buffer；

22、5μl模板；

23、四种外引物对均为100nm，各2.5μl；

24、四种内引物对均为100nm，)各3μl；

25、四种探针均为50nm，各1μl；

26、余量为pcr所需的mg2+，dntp，taq dna聚合酶，ung酶，逆转录酶，及无核酸酶水。

27、本发明提供一种检测猫消化道病原体的方法，包括：

28、提取猫消化道核酸；

29、将所述核酸在pcr扩增仪上进行扩增；以及

30、将所述扩增的产物进行检测；

31、其中，使用的引物包括：

32、检测猫细小病毒的如seq id no.1~2所示的外引物对和如seq id no.3~4所示的内引物对；

33、检测猫肠道冠状病毒的如seq id no.6~7所示的外引物对和如seq id no.8~9所示的内引物对；

34、检测猫传染性腹膜炎病毒的如seq id no.11~12所示的外引物对和如seq idno.13~14所示的内引物对；

35、检测猫衣原体的如seq id no.16~17所示的外引物对和如seq id no.18~19所示的内引物对。

36、进一步地，所述核酸在pcr扩增仪上进行扩增的步骤具体包括：

37、将四种所述外引物对和四种所述内引物对分别加入所述多重pcr反应体系中，进行如下的pcr反应程序：5℃预变性 5 min；95℃变性 15 s，70℃退火 30 s，72℃延伸 40s，循环 15次；95℃变性 15 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 15 s，循环40次。

38、进一步地，所述检测包括对回收所述电泳条带进行纳米孔测序。

39、进一步地，所述方法还包括向反应体系中加入如seq id no.21~25所示的探针，并根据扩增产物产生的荧光信号扩增曲线检测猫消化道病毒。

40、另外，本发明还提供所述的试剂盒在检测猫消化道病原体体外样品中的应用的。

41、本发明的有益效果在于：采用一个多重pcr反应体系能够有效、协同地扩增出待检测样品中猫消化道病原体：猫细小病毒、猫肠道冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和猫衣原体的特异性序列，扩增效果准确，灵敏度和重复性高；四组四重引物/探针无交叉污染及干扰，而且使用目前常规的市售实时荧光pcr设备，无须改造，操作方便并节省成本，进一步节约了成本。