漆酶突变体及其应用

本发明涉及酶的突变体，尤其涉及漆酶突变体及其应用，属于漆酶突变体及其应用领域。

背景技术：

1、漆酶(laccase，ec1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于多铜氧化酶(mcos)家族，其活性中心包含四个铜离子：可催化多种酚类和非酚类芳香化合物的氧化，同时将氧还原成水。漆酶因其优越的底物宽泛性，可氧化降解许多有害物质，广泛用于食品工业、染料脱色、制浆、漂白及造纸废水处理等方面，在有毒化合物和致癌物的生物修复中具有巨大的应用潜力。

2、漆酶13b22从农药污染的土壤中筛选获得，首先提取土壤宏基因组后构建fosmid文库，然后利用漆酶基因的保守序列设计简并引物，使用tail-pcr从宏基因组中得到了漆酶13b22的基因全长，并成功在大肠杆菌中进行异源表达。漆酶13b22对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（简称abts）的最适反应温度为40℃，最适反应ph值为6.0。现有的野生型漆酶13b22的最适温度较低且酶活较低，对于有毒化合物的降解效果欠佳，有待改进。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是将野生型漆酶13b22进行突变获得的突变体，所得到的突变体最适温度明显提升，酶活提升并且对于有毒化合物的降解效果有明显改善；

2、本发明的目的之二是提供野生型漆酶13b22突变体编码基因；

3、本发明的目的之三是提供含有野生型漆酶13b22突变体编码基的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞。

4、本发明的目的之四是将所述的突变体应用于降解毒性化合物。

5、本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

6、本发明的一方面是将氨基酸序列为seq id no.1所示的野生型漆酶13b22分别进行d511e、v435i、i88l、h436e、g430s、v378i、i424f、n367d、i129l、w502f、h439y或s248a单位点突变获得了12个单位点突变体，即：13b22-d511e、13b22-v435i、13b22-i88l、13b22-h436e、13b22-g430s、13b22-v378i、13b22-i424f、13b22-n367d、13b22-i129l、13b22-w502f、13b22-h439y和13b22-s248a；优选的，将氨基酸序列为seq id no.1所示的野生型漆酶13b22分别进行d511e、v435i或i88l这3个单位点突变得到3个单位点突变体13b22-d511e、13b22-v435i、13b22-i88l；最优选的，将氨基酸序列为seq id no.1所示的野生型漆酶13b22进行d511e单位点突变得到单位点突变体13b22-d511e。

7、本发明所述氨基酸单位点突变“d511e”表示将seq id no.1所示的氨基酸序列的第511位氨基酸由天冬氨酸（d）突变成谷氨酸（e）；其余的单位点突变的表述依此类推。

8、本发明中所述的野生型漆酶13b22的12个单位点突变体的编码基因也属于本发明的保护范畴之内。

9、本发明的另一方面是提供了含有所述漆酶13b22突变体编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。

10、本发明的另一方面是提供制备漆酶13b22突变体的方法，包括：

11、（1）将漆酶13b22突变体编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；

12、（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。

13、本发明将氨基酸序列为seq id no.1所示的野生型漆酶13b22分别进行d511e、v435i、i88l、h436e、g430s、v378i、i424f、n367d、i129l、w502f、h439y和s248a单位点突变获得了12个单位点突变体，即：13b22-d511e、13b22-v435i、13b22-i88l、13b22-h436e、13b22-g430s、13b22-v378i、13b22-i424f、13b22-n367d、13b22-i129l、13b22-w502f、13b22-h439y和13b22-s248a；其中13b22-d511e、13b22-v435i和13b22-i88l这三个单位点突变体的酶活相较野生型13b22分别提高约3倍左右。鉴于d511距离t1铜离子最近，t1铜离子主要发挥对底物的氧化作用，因此本技术选择13b22-d511e这一突变体进行了酶学性能测定以及对于玉米赤霉烯酮、棉酚和苯并芘的降解效果试验。

14、根据酶学活性测定结果可见，野生型漆酶13b22在40℃时酶活最高，单点突变体13b22-d511e在55℃时酶活最高，相较野生型13b22，突变体13b22-d511e最适温度提高15℃，在其最适温度55℃下酶活相较野生型提高了2.26倍；分别在最适温度40℃和55℃下测定在不同ph值条件下的酶活，结果表明，在ph 5.0-6.5范围内，野生型漆酶13b22和突变体13b22-d511e的相对酶活保持在70%以上，在ph 6.0时，酶活达到最高。

15、本发明进一步测定了野生型漆酶13b22及其单位点突变体13b22-d511e对玉米赤霉烯酮、棉酚和苯并芘的降解效果；根据测定结果可见，野生型漆酶13b22及其突变体13b22-d511e对玉米赤霉烯酮、棉酚和苯并芘均有一定的降解效果，其中，对玉米赤霉烯酮的降解效果最佳。在55℃条件下反应2h，突变体13b22-d511e对玉米赤霉烯酮的降解率几乎100%，相较野生型提高了10-15%；在55℃条件下反应1h，突变体13b22-d511e对棉酚的降解率也优于野生型漆酶13b22，相较野生型漆酶13b22提高了5%-10%；在55℃条件下反应2h，突变体13b22-d511e对苯并芘的降解率达到了60%以上，相较野生型漆酶13b22提高5%；因此，突变体13b22-d511e对于各种毒性化合物的降解效果明显优于野生型漆酶13b22。

16、相应的，本发明提供了野生型漆酶13b22突变体在降解毒性化合物中的应用；其中，所述的毒性化合物包括但不限于玉米赤霉烯酮、棉酚或苯并芘中的任何一种。

17、本发明所涉及到的术语定义

18、除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

19、术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。

20、术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

21、术语“转化”指真核细胞由于外源dna掺入而获得新的遗传标志的过程。