一株森林土源芽孢杆菌及其用途的制作方法

本发明属于微生物和烟叶脂质提取领域，具体涉及一株森林土源芽孢杆菌及其在提取烟叶长链脂肪酸及长链脂肪酸酯中的应用。

背景技术：

1、森林土源芽孢杆菌(solibacillus silvestris)是烟草田间和烟叶表面常见的微生物，现有技术少见其产酶及用途报道，也未知森林土源芽孢杆菌对烟叶的作用效果。

2、长链脂肪酸又称高级脂肪酸，对烟叶品质有重要影响。长链脂肪酸酯能够提升烟叶的香气质。

3、超声辅助溶剂提取是当下提取烟叶中长链脂肪酸和长链脂肪酸酯较为便捷的方式，仪器设备普及性强，操作简单。但由于烟叶细胞壁较厚，超声提取效率不高。此外，烤后烟叶中的醌类物质或者叶黄素、类胡萝卜等质体色素会干扰长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的提取。因此，需要新的提取烟叶长链脂肪酸及长链脂肪酸酯的方法。

技术实现思路

1、本发明的第一方面提供了一种森林土源芽孢杆菌(solibacillus silvestris)5-1，其包含16s rrna核酸，所述16s rrna核酸与seq idno:3所示的核酸具有至少98％的同一性。

2、在某些实施方案中，所述16s rrna核酸与seq id no:3所示的核酸具有至少99％的同一性。

3、在某些实施方案中，所述16s rrna核酸具有如seq id no:3所示的核酸序列。

4、在某些实施方案中，所述森林土源芽孢杆菌5-1，其保藏号为cgmcc no.24250。

5、本发明的第二方面提供了一种培养物，其包括本发明所述的森林土源芽孢杆菌5-1，以及任选的培养基。

6、在某些实施方案中，所述的培养基包括果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠。

7、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为1-15:0.5-2:3-10:3-10:0.5-5:1-8:0.5-2:1-10。

8、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为3-10:0.8-1.2:4-8:4-8:1-3:2-6:0.8-1.2:3-7。

9、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为5:1:6:6:2:4:1:5。

10、在某些实施方案中，所述培养基中还含有烟叶粉末或可溶性淀粉。

11、在某些实施方案中，所述烟叶粉末为60～100目的烟叶粉末。

12、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为10-40:0.5-2。

13、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为12-25:0.8-1.2。

14、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为15:1。

15、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为10-30:0.5-2。

16、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为12-20:0.8-1.2。

17、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为15:1。

18、在某些实施方案中，所述发酵培养基是液体培养基、固体培养基或半固体培养基。

19、本发明的第三方面提供了一种培养物上清，其为本发明所述的培养物的上清。

20、本发明的第四方面提供了一种组合物，其包括本发明所述的森林土源芽孢杆菌5-1，或本发明所述的培养物，或本发明所述的培养物上清。

21、本发明的第五方面提供了一种组合物，其由本发明所述的培养物上清制备而成。

22、本发明的第六方面提供了一种酶制剂，其中含有果胶酶、纤维素酶和淀粉酶。

23、在某些实施方案中，所述酶制剂由本发明所述的森林土源芽孢杆菌5-1在培养基中发酵获得，其中，所述培养基包括果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠。

24、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为1-15:0.5-2:3-10:3-10:0.5-5:1-8:0.5-2:1-10。

25、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为3-10:0.8-1.2:4-8:4-8:1-3:2-6:0.8-1.2:3-7。

26、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为5:1:6:6:2:4:1:5。

27、在某些实施方案中，所述培养基中还含有烟叶粉末或可溶性淀粉。

28、在某些实施方案中，所述烟叶粉末为60～100目的烟叶粉末。

29、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为10-40:0.5-2。

30、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为12-25:0.8-1.2。

31、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为15:1。

32、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为10-30:0.5-2。

33、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为12-20:0.8-1.2。

34、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为15:1。

35、在某些实施方案中，所述发酵培养基是液体培养基、固体培养基或半固体培养基。

36、在某些实施方案中，所述酶制剂由包括以下操作的方法制备而成，

37、1)将本发明所述的森林土源芽孢杆菌5-1接种至所述培养基中；

38、2)发酵。

39、在某些实施方案中，步骤2)中所述发酵为在28-32℃、100-200r/min转速下发酵18-30小时。

40、在某些实施方案中，步骤2)后还包括以下操作中的至少一项：

41、去除菌体；

42、去除分子量大于150kda的物质；

43、去除分子量小于10kda的物质；

44、干燥发酵液。

45、在某些实施方案中，应用150kda超滤膜去除分子量大于150kda的物质。

46、在某些实施方案中，应用10kda超滤膜去除分子量小于10kda的物质。

47、在某些实施方案中，所述干燥为冷冻干燥。

48、本发明的第七方面提供了制备酶制剂的方法，其包括以下步骤：

49、1)将本发明所述的森林土源芽孢杆菌5-1接种至所述培养基中；

50、2)发酵。

51、在某些实施方案中，步骤2)中所述发酵为在28-32℃、100-200r/min转速下发酵18-30小时；

52、在某些实施方案中，步骤2)后还包括以下操作中的至少一项：

53、去除菌体；

54、去除分子量大于150kda的物质；

55、去除分子量小于10kda的物质；

56、干燥发酵液。

57、在某些实施方案中，应用150kda超滤膜去除分子量大于150kda的物质。

58、在某些实施方案中，应用10kda超滤膜去除分子量小于10kda的物质。

59、在某些实施方案中，所述干燥为冷冻干燥。

60、本发明的第八方面提供了本发明所述的森林土源芽孢杆菌5-1或本发明所述的培养物或本发明所述的培养物上清或本发明所述的组合物或本发明所述的酶制剂在提取烟叶中的长链脂肪酸及长链脂肪酸酯中的用途。

61、本发明的第九方面提供了一种提取烟叶中的长链脂肪酸及长链脂肪酸酯的方法，其包括以下步骤：

62、1)将本发明所述的培养物上清或本发明所述的组合物或本发明所述的酶制剂与烟叶粉末混合，反应；

63、2)固液分离；

64、3)向所得固体中加入有机溶剂，混合，固液分离，所得液体含有长链脂肪酸及长链脂肪酸酯。

65、在某些实施方案中，所述有机溶剂为二氯甲烷。

66、在某些实施方案中，步骤1)混合后在35-45℃反应20-60min。

67、在某些实施方案中，步骤2)中所述固液分离的方式为离心。在某些实施方案中，所述离心条件为10000-14000r/min离心10-20min。

68、在某些实施方案中，步骤2)之后还包括用乙醇脱色。在某些实施方案中，所述脱色包括以下操作：向所得固体中加入乙醇，混合；固液分离。在某些实施方案中，所述乙醇为60-90％乙醇。在某些实施方案中，所述乙醇为75％乙醇。在某些实施方案中，加入的乙醇的量为20-60ml/g烟叶粉末。在某些实施方案中，所述混合为在45-55℃、250-350w的条件下超声混合20-40min。在某些实施方案中，所述固液分离的方式为离心。在某些实施方案中，所述离心条件为10000-14000r/min离心10-20min。

69、在某些实施方案中，步骤3)中所述混合为在45-55℃、250-350w的条件下超声混合20-40min。

70、在某些实施方案中，步骤3)中所述固液分离的方式为离心。在某些实施方案中，所述离心条件为10000-14000r/min离心10-20min。

71、本发明的第十方面提供了一种培养基，其包括果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠。

72、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为1-15:0.5-2:3-10:3-10:0.5-5:1-8:0.5-2:1-10。

73、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为3-10:0.8-1.2:4-8:4-8:1-3:2-6:0.8-1.2:3-7。

74、在某些实施方案中，所述果胶、羧甲基纤维素钠、酵母粉、蛋白胨、氯化钙、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和磷酸二氢钠的重量比为5:1:6:6:2:4:1:5。

75、在某些实施方案中，所述培养基中还含有烟叶粉末或可溶性淀粉。

76、在某些实施方案中，所述烟叶粉末为60～100目的烟叶粉末。

77、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为10-40:0.5-2。

78、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为12-25:0.8-1.2。

79、在某些实施方案中，所述烟叶粉末和羧甲基纤维素钠的重量比为15:1。

80、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为10-30:0.5-2。

81、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为12-20:0.8-1.2。

82、在某些实施方案中，所述可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠的重量比为15:1。

83、在某些实施方案中，所述发酵培养基是液体培养基、固体培养基或半固体培养基。

84、本发明所述的培养基可用于维持和/或促进枯森林土源芽孢杆菌5-1生长、繁殖和/或代谢。

85、本发明取得的有益效果：

86、(1)本发明得到了一株新的森林土源芽孢杆菌5-1(cgmccno.24250)，其可兼产果胶酶、纤维素酶和淀粉酶；

87、(2)本发明提供的培养物、培养物上清、组合物、酶制剂能提高烟叶中长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的提取效率；

88、(3)本发明提供的培养基能使森林土源芽孢杆菌5-1同时产果胶酶、纤维素酶和淀粉酶，并且在发酵培养基中添加烟叶粉末可促进森林土源芽孢杆菌5-1增产果胶酶、纤维素酶和淀粉酶；

89、(4)在提取烟叶中长链脂肪酸和长链脂肪酸酯时使用75％乙醇进行脱色处理，可使其提取液更加洁净，且不降低长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的提取量。

90、关于生物材料保藏的说明

91、森林土源芽孢杆菌(solibacillus silvestris)5-1已在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china generalmicrobiological culture collection center,cgmcc)进行保藏，其保藏号为cgmccno.24250，保藏时间为2022年01月05日。