一种同时检测同型半胱氨酸和粘度的双功能荧光探针的合成与应用

本发明属于分析化学，具体涉及一种同时区分成像同型半胱氨酸和粘度的双功能荧光探针的合成与应用。该探针通过哌嗪将两个荧光团结合起来并能从各种生物活性物质中快速选择性检测同型半胱氨酸和粘度，红色荧光通道选择性检测同型半胱氨酸，近红外荧光通道选择性检测粘度，具有大斯托克斯位移、检测灵敏度高和可视化检测等优点。

背景技术：

1、同型半胱氨酸（homocysteine, hcy）是一种含硫氨基酸，为蛋氨酸代谢过程中产生的重要中间产物，具有细胞毒性。正常情况下人血清中总hcy的浓度为5–15 µm（diabetesand vascular disease research 2007, 4, 143-149）。过高的hcy水平可产生大量活性氧物种（ros），具有直接引起血管内皮损害、促进氧化低密度脂蛋白形成、血小板集聚等作用而促发动脉粥样硬化的发生，是引起心脑血管疾病的危险因素（new england journal ofmedicine 2002, 346, 476-483）。hcy也是一种具有神经毒性的含硫氨基酸，可以诱导dna链断裂、淀粉样蛋白聚集、氧化应激和细胞凋亡（cell death&disease 2016, 7, e2513-e2513），临床研究发现其在多种神经系统疾病中累积。hcy浓度升高与多种疾病存在密切关系，是最为准确的健康指标，但其致病机制尚未完全清楚（international journal ofmolecular sciences 2016, 17, 1733），这可能是缺乏hcy与之相关联物质的了解。粘度，细胞微环境的重要参数之一，维持正常的细胞内粘度对于营养物质和代谢产物的输送、细胞内和细胞间信号转导、生物大分子之间的相互作用和其他生理过程至关重要（biochem.pharmacol., 1995, 49, 1589）。当细胞发生病理改变和凋亡时，细胞内微环境将首先发生变化，导致生物大分子的分子间偶联增加细胞内粘度（j. am, chem. soc., 2019, 141,18301；chem. commun., 2021, 57, 3508）。细胞内粘度的异常变化与癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病等有重要关系。

2、目前，已经开发了多种方法来检测hcy和粘度，例如液相色谱-质谱法 (lcms)、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法 (gcms) 和荧光光谱法。在这些检测方法中，荧光探针分析由于具有快速响应和高灵敏度的能力，以及空间分辨率和令人满意的生物相容性而普遍受到青睐(angew. chem. int. ed. 2017, 56, 16611–16615; anal. chem. 2016, 76,166–181)。已经报道了许多用于检测hcy/粘度的荧光探针，它们绝大部分均单独检测其中的一种(angew. chem. int. ed. 2018,  57, 4991; analyst, 2022, 147, 2470)。并且同型半胱氨酸和半胱氨酸结构相似，难以区分，因此，对于同时检测同型半胱氨酸和粘度而无其他物质的干扰，尤其困难，是目前研究的难题之一。

技术实现思路

1、鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时区分同型半胱氨酸和粘度的双功能荧光探针。该探针能在特定检测条件下，从各类生物活性物质中快速选择性荧光检测同型半胱氨酸和粘度。

2、本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、高灵敏度、检测限低和成本较低的上述双功能荧光探针的合成与应用方法。

3、本发明解决问题采取的具体技术方案为，一种同时区分同型半胱氨酸和粘度的双功能荧光探针的合成以及制备在环境中定量分析同型半胱氨酸和粘度，在活细胞中同时区分成像同型半胱氨酸和粘度的器件的应用，其探针的化学结构式如下：

4、。

5、一种同时区分同型半胱氨酸和粘度的双功能荧光探针的合成，其特征在于，所述双功能荧光探针的制备方法包括以下步骤：

6、步骤1. 合成5-5-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-羰基)-2-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘化氢4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-羰基)-2-((1e，3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘化氢

7、将5-羧基-2-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘化物加入无水二氯甲烷中，再加入4-二甲氨基吡啶（dmap），搅拌5min，随后加入1-boc-哌嗪和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edci），室温搅拌反应过夜，反应完全后，柱层析分离纯化得到5-5-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-羰基)-2-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘化氢4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-羰基)-2-((1e，3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘化氢；

8、步骤2. 合成2-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-5-(哌嗪-1-基-1-羰基)-3h-吲哚-1-基2,2,2-三氟乙酸盐碘化物

9、将5-5-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-羰基)-2-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘化氢4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-羰基)-2-((1e，3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘化氢加入无水二氯甲烷中，然后再加入三氟乙酸，常温搅拌过夜，反应完全后，旋干反应体系，柱层析分离纯化得到2-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-5-(哌嗪-1-基-1-羰基)-3h-吲哚-1-基2,2,2-三氟乙酸盐碘化物；

10、步骤3. 合成( e) -2-(2-(4-(丁硫基)-7-(二乙基氨基)-6-硝基-2-氧代-2h-铬烯-3-基）-1-氰基乙烯基)苯并[d]噻唑-6-羧酸

11、将4-(丁硫基)-7-(二乙基氨基)-6-硝基-2-氧代-2h-铬烯-3-甲醛和2-（氰基甲基）苯并[d]噻唑-6-羧酸加入无水乙醇中，在50℃搅拌反应24小时，反应完全后，旋干反应体系，柱层析分离纯化得到( e) -2-(2-(4-(丁硫基)-7-(二乙基氨基)-6-硝基-2-氧代-2h-铬烯-3-基）-1-氰基乙烯基)苯并[d]噻唑-6-羧酸；

12、步骤4. 合成所述的双功能荧光探针

13、将( e) -2-(2-(4-(丁硫基)-7-(二乙基氨基)-6-硝基-2-氧代-2h-铬烯-3-基）-1-氰基乙烯基)苯并[d]噻唑-6-羧酸加入无水二氯甲烷中，再加入4-二甲氨基吡啶(dmap)，常温反应5 min，随后加入2-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-5-(哌嗪-1-基-1-羰基)-3h-吲哚-1-基2,2,2-三氟乙酸盐碘化物搅拌5min后，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，常温搅拌过夜，反应完全后，反应体系旋干，柱层析纯化分离得到所述的双功能荧光探针。

14、本发明的一种同时区分同型半胱氨酸和粘度的双功能荧光探针的使用方法：无特殊说明，通常在室温下将双功能探针溶解在二甲基亚砜(dmso)中，有机相和水相体积比为5：5的环境下用于分析检测，有机相为二甲基亚砜(dmso)，水相为ph = 7.4的磷酸盐缓冲溶液 (pbs)。

15、本发明的双功能荧光探针同时区分同型半胱氨酸和粘度的具体特征如下：该双功能荧光探针用二甲基亚砜(dmso)溶解，该双功能探针溶解在有机相和水相(5:5,v/v)溶液中，与同型半胱氨酸30分钟后，在575 nm激发波长下发射654 nm的红色荧光；探针在甘油-甲醇(v:v=5：5)作用下，在650 nm激发波长下发射720 nm的近红外荧光。因此，实现以特定激发和荧光发射信号检测特定分析物，当两种物质均存在时，利用不同的激发和荧光发射信号也能很好地将两者区分。上述双功能荧光探针实现了在不同检测条件下同时区分检测同型半胱氨酸和粘度，对其他活性氧、活性硫、常见的氨基酸、金属离子和活性氮均无明显响应，对同型半胱氨酸和粘度两者的检测限分别低至249.6 μm和0.14 cp。因此，本发明公开的双功能荧光探针能够实现对两者的高灵敏区分定量检测。