一种核酸等温检测方法

本发明属于microrna检测，具体涉及一种核酸等温检测方法，是一种crispr/cas13a介导的无需逆转录且高灵敏的microrna等温检测方法。

背景技术：

0、技术背景

1、microrna是一类小的非编码rna分子。成熟的microrna来源于70-100个核苷酸的发夹前体分子，最终被加工成长度为19-25个碱基的单链rna(cell,2004,116(2):281-297)。迄今为止报道的人类成熟microrna的数量超过2600个，其参与关键的生物学过程广泛，包括增殖、分化和凋亡，它经典功能是通过促进mrna衰变或抑制翻译，在转录后抑制特定靶蛋白的表达。microrna不仅具有高度组织特异性，且被证实在癌症基因表达调控中具有重要作用(nature reviews cancer,2006,6(4):259-269)。特别是microrna具有抗核糖核酸酶消化的特性，且对反复冻融循环和长期储存稳定，作为疾病诊断和预后的新型生物标志物具有独特的优势(trends in molecular medicine,2014,20(8):460-469)。

2、针对microrna的检测方法种类繁多且日趋成熟，包括northern blotting、下一代测序技术、microarray技术以及rt-pcr技术。首个microrna的发现就是通过northernblotting，但是由于其通量低、时间花费久、灵敏度低(从pm到nm范围)，只能提供相对定量的目标分子等缺点，极大地限制了该方法的应用。ngs具有广泛的应用范围，在区分相似序列的microrna方面具有较高的灵敏度和准确性、以及较高的通量。然而，它需要昂贵的设备和经验丰富的信息专家来确保正确的数据分析。微阵列技术涉及高密度dna探针斑点装饰的玻璃或聚合物膜支撑(或颗粒)，相对丰度是根据信号强度来测量的。该方法的检测通量高，但是灵敏度低和特异性都欠佳。rt-qpcr虽然是microrna高灵敏度检测的金标准，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短等优势(nucleic acids research,2005,33(20):e179)，但是在反应条件上仍然需要复杂的温控装置，对昂贵和精密仪器的依赖程度高，不适用于医疗条件匮乏的检测场景。目前，尚且缺乏兼具高灵敏和简便特征的microrna检测方法。

3、连接法是microrna在实现靶标扩增前的一种前处理方法之一，能将短小的microrna转变成合适的长度以满足引物结合等扩增条件(nucleic acids research,2016,44(13):e116)。基本原理是通设计与microrna序列互补配对的探针，利用连接酶(t4rnaligase2、splintr ligase等)将两段探针连接，形成可进行扩增的dna单链，将检测目标从microrna转换成连接成功的探针序列。基于连接酶的方法最大的优势是在无需逆转录便可实现microrna的检测。然而，目前基于连接法的microrna检测方法后续大多通过变温扩增技术(如pcr等)或者需要复杂引物设计的恒温扩增技术(如lamp技术等)进行扩增，尚且缺乏简便、恒温的无需逆转录microrna检测方法。

4、crispr系统是微生物适应性免疫系统的基本组成部分，该系统通过特定的crrna序列识别外源核酸，随后通过cas(crispr-associated)酶将其清除(science,2017,356(6333):eaal5056)。自从crispr系统被用于分子诊断领域，大量相关的检测方法被开发，其中最常用的cas酶主要有三种：cas9，cas12和cas13，前两者检测的是dna，而cas13的检测目标则是rna。cas13是一种rna引导的rna核酸内切酶，可在crrna的引导下特异性切割单链靶标rna，并在完成切割后，可继续保持活性并切割其他非靶标rna。基于cas13开发的分子诊断技术主要为sherlock(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)，其反应原理是靶标核酸经等温扩增技术rpa扩增并引入t7启动子序列后，再利用t7 rna聚合酶转录形成ssrna，转录产物与cas13a-crrna结合，激活cas13a核酸酶活性，切割ssrna荧光探针，释放可被检测的荧光基团(nature protocols,2019,14(10):2986-3012)。基于sherlock的分子诊断技术能在37℃条件下实现靶标分子的高灵敏检测，对仪器依赖度低，相较于传统pcr技术优势更加明显，在现场检测领域显示出巨大的潜力。然而，sherlock技术目前在microrna检测方面的研究尚有空缺，因此亟需开发基于sherlock技术的microrna等温、高灵敏方法及验证其在临床检测方面的能力。

技术实现思路

1、本发明一方面提供一种核酸等温检测方法，包括(1)基于连接酶的连接反应，(2)重组聚合酶扩增反应和(3)crispr/cas13a介导的信号放大反应，实现靶标microrna的指数级扩增从而获得相应的荧光信号累积，实现microrna的高灵敏检测。

2、其中，所述连接反应包含连接连接酶、连接探针、待测核酸样本；所述重组聚合酶扩增反应包含引物；所述crispr/cas13a介导的信号放大反应包含向导rna、探针、反应缓冲液。

3、步骤(1)基于连接酶的连接反应中，所述连接酶为dna连接酶或者rna连接酶；优选地，所述的连接酶是rna连接酶；更优选地，所述的rna连接酶为t4 rna连接酶2。

4、所述连接探针为probe1和probe2，且分别与靶标microrna互补配对；优选地，在所述的连接探针probe1的5’端修饰有磷酸基团，probe2的3’端修饰有羟基基团。其中所述的连接探针probe1和probe2浓度为5～500pm；优选地，所述的连接探针probe1和probe2浓度为50pm。

5、所述的连接反应条件为37℃，反应时间为5-120分钟。

6、步骤(2)所述的重组聚合酶扩增反应中，其中一条引物(f1)的5’端带有t7启动子序列，长度为45～57bp，另一条引物(r1)长度为20～32bp；优选地，所述引物的长度分别为51bp和26bp。

7、所述的重组聚合酶扩增反应中引物浓度为100-1000nm；优选地，所述引物浓度为480nm。

8、步骤(3)crispr/cas13a介导的信号放大反应中，crrna的靶向序列是与目标microrna特异性互补的。

9、所述crispr/cas13a介导的信号放大反应中crrna浓度为5-100nm；优选地，所述crrna浓度为20nm。

10、所述crispr/cas13a介导的信号放大反应中荧光探针5’端带有fam基团修饰，3’端带有bhq1基团修饰，荧光探针序列一般为5个u组成。

11、所述crispr/cas13a介导的信号放大反应中反应缓冲液为twistamp basic kit配套的缓冲液。

12、本发明步骤(1)之前还包括生物样本的预处理，其包括生物样本中的总microrna提取，提取过程使用商品化试剂盒。所述的待测核酸样本包括来自生物样本的核酸；任选地，所述的生物样本选自：血液、细胞、血清、唾液、体液、血浆、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、腹腔液、粪便或其组合。

13、本发明等温高灵敏microrna检测方法，经灵敏度和特异性结果考查，进一步展示本发明优异的定量性能，有潜力成为临床上microrna的快速筛查工具。

14、发明的有益效果：目前microrna的检测方法多数基于核酸扩增过程，且一般需要提前将microrna进行逆转录处理，逆转录的过程耗时久，严重影响检测效率；且逆转录产物多用于pcr扩增的模板，而难以适用于大多数常见的恒温扩增方法。本发明提供的方法及体系首次建立了基于连接反应和sherlock的microrna检测体系，结合了连接反应无需逆转录的特点和sherlock反应的高灵敏性及高特异性优势，无需逆转录即可实现microrna的高灵敏、等温检测，主要具有以下几个优势：(1)无需逆转录的条件即可实现microrna检测，极大缩短了检测时间，提高了检测效率，为现场检测提供有效方案；(2)等温扩增可以很大限度减少对精密温控设备的依赖，降低检测成本；仅通过37℃的孵育即可实现microrna的扩增和检测，过程简单易操作，适合医疗条件匮乏和疾病快速筛查场景；(3)灵敏度高，最低能实现浓度为102拷贝/μl的microrna检测，对低丰度核酸的精准检测具有很大应用价值；样本使用量少，仅1μl即可实现高灵敏检测，对微量样本检测方面具有重要价值。