一种燕窝黏蛋白型Tn抗原的生物合成方法

本发明涉及一种燕窝黏蛋白型tn抗原的生物合成方法。

背景技术：

1、黏蛋白上的o-聚糖在维持黏蛋白的结构和功能以及黏蛋白与其他分子和细胞的相互作用中发挥着重要作用。黏蛋白被发现在免疫系统中发挥重要作用，因为它们可以作为调理素，促进病原体和毒素的清除。黏蛋白还可以激活免疫细胞，刺激细胞因子和趋化因子的产生，这在炎症和免疫反应中很重要。

2、目前而言，tn抗原可以通过koenigs-knorr及其改良法、eedq法、三氟乙酰亚胺酯法进行合成，糖基化反应是其中的关键步骤，其糖基化反应的催化剂一般都是重金属盐，且产率较低；由于tn抗原o-糖苷键相当于缩醛结构，具有缩醛的化学敏感性，遇酸会被切断或发生端基异构化。

3、tn抗原的形成与肿瘤的发生及转移密切相关，在70-90％的肿瘤中均发现了tn抗原的存在，因此对tn抗原的生物合成及其生物学功能研究在肿瘤疫苗的合成方面具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对背景技术提出的技术问题，本发明的目的在于提供一种燕窝黏蛋白型tn抗原的生物合成方法。

2、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

3、一种燕窝黏蛋白型tn抗原的生物合成方法，以糖核苷酸udp-乙酰氨基半乳糖(udp-galnac)作为糖基供体，燕窝黏蛋白(afmuc)作为糖基受体，采用多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶(hsgalnt2)作为糖蛋白o-糖基化修饰的起始糖基转移酶，通过酶法生物合成燕窝黏蛋白型tn抗原。

4、作为一种优选技术方案，所述酶法生物合成的反应体系中还添加mn2+作为辅助因子。

5、在本发明的具体实施方式中，10μl所述反应体系的成分为：ph 7.0，500mm mesbuffer 1μl，10mm mncl2 1μl，10mm udp-galnac 1μl，afmuc 2μl和hsgalnt2 5μl。

6、在本发明的具体实施方式中，所述酶法生物合成的反应条件为：ph 7.0、37℃条件下反应12h。

7、进一步优选的，所述的燕窝黏蛋白afmuc来源于aerodramus fucipagus，其编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，是通过异源表达获得燕窝黏蛋白afmuc。所述的燕窝黏蛋白在e.coli bl21(de3)细胞中进行表达。

8、进一步优选的，所述的多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶(hsgalnt2)来源于homosapiens，其编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，是通过异源表达获得多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶(hsgalnt2)。所述的多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶(hsgalnt2)在e.colibl21(de3)细胞中进行表达。

9、燕窝黏蛋白afmuc的异源表达：寻找编码黏蛋白的基因序列，并对其进行基因合成，将基因序列连接到pgem-t载体上构建重组质粒，将重组质粒导入e.coli bl21(de3)细胞中进行表达，并通过ni-nta亲和层析法对蛋白进行纯化，sds-page进行分析纯化结果。

10、多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶hsgalnt2的异源表达：寻找编码多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶的基因序列，并对其进行基因克隆，表达纯化，western-blot进行纯化结果分析。对表达得到的重组蛋白进行活性评估。

11、在本发明的具体实施方式中，通过对三种aerodramus fucipagus来源的燕窝黏蛋白进行异源表达和homo sapiens源的多肽：n-乙酰氨基半乳糖转移酶进行基因克隆，并将其转化进大肠杆菌bl 21(de3)感受态细胞中进行诱导表达和纯化。经sds-page分析和western-blot分析之后，说明重组蛋白均可以被成功表达纯化。使用高效液相色谱法检测hsgalnt2的活性，并用maldi-tof检测分子量，得出重组多肽：n-乙酰氨基半乳糖转移酶hsgalnt2具有转移galnac到多肽上面的活性，采用表达的重组燕窝黏蛋白afmuc作为糖基受体，在hsgalnt2的催化作用下，燕窝黏蛋白afmuc可以接受多个galnac，形成含多个tn抗原的燕窝黏蛋白。

12、在本发明的更具体的实施方式中，将燕窝黏蛋白、n-乙酰氨基半乳糖转移酶和udp-galnac在ph 7.0、37℃条件下反应12h，同时添加mn2+作为辅助因子。使用udp-gallnac作为糖基供体，纯化得到的燕窝黏蛋白afmuc作为糖基受体，使galnac转移到黏蛋白afmuc的丝氨酸或者丝氨酸残基上，从而得到含多个tn抗原的燕窝黏蛋白。使用maldi-tof对反应结果进行验证，确认产物分子量，表明燕窝黏蛋白型tn抗原合成成功。

13、上述方法制备的燕窝黏蛋白型tn抗原也属于本发明的保护范围。

14、上述的燕窝黏蛋白型tn抗原在制备肿瘤疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

15、本发明还保护上述燕窝黏蛋白型tn抗原在制备治疗糖基化相关疾病的药物中的应用。

16、生物酶法合成tn抗原具有高效性、专一性、反应条件温和等优点，不需要高温高压条件即可完成。多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶是糖蛋白o-糖基化修饰的起始糖基转移酶，可将活性供体糖核苷酸udp-乙酰氨基半乳糖(udp-galnac)中的乙酰氨基半乳糖(galnac)转移至受体多肽链中丝氨酸(ser)或苏氨酸(thr)上，形成galnacα-o-ser/thr结构，即tn抗原结构。

17、本发明的有益效果：

18、本发明提供了一种新型的燕窝黏蛋白的体外合成方法，燕窝黏蛋白对可食用燕窝的营养价值具有重要影响。有大量关于小鼠或大鼠体内实验探究了可食用燕窝摄入后对小鼠、大鼠发育及疾病预防产生的功能效应，如增强骨强度和钙离子浓度，减轻高脂饮食引起的凝血作用，防止胰岛素抵抗，神经保护增强学习记忆，降血压、预防肥胖相关应激反应，防止重金属如镉、铅的蓄积等。

19、燕窝黏蛋白型tn抗原的生物合成是在多肽n-乙酰氨基半乳糖转移酶的作用下，通过对成熟黏蛋白中的丝氨酸或苏氨酸连接galnac进行糖基化修饰产生的。tn抗原的形成与肿瘤的发生及转移密切相关，在70-90％的肿瘤中均发现了tn抗原的存在，因此对tn抗原的生物合成及其生物学功能研究具有重要的意义。得到高纯度含有tn抗原的燕窝黏蛋白后，可以建立肿瘤动物(小鼠)模型，研究tn抗原与肿瘤之间的关系，为开发新型的肿瘤疫苗提供依据。

20、tn抗原可进一步被修饰形成更加复杂的o-聚糖结构。1个gal通过β-1,3糖苷键链接到tn抗原上形成t抗原((galβ1,3galnac-α-ser/thr))，即core1核心结构。core 2核心结构的形成过程是glcnac添加到t抗原上。tn抗原不仅可以用于合成t抗原，还可以合成核心2型、核心3型(glcnacβ1,3galnac-α-ser/thr)、核心4型(glcnacβ1,3galnac-α-ser/thr)以及核心5型结构。

21、本发明提供一种燕窝黏蛋白型tn抗原的生物合成方法，就燕窝o-galnac型黏蛋白结构合成进行了解释，为体内生理功能的探究奠定基础，也更好的促进了糖组学与糖生物工程和食品领域的有机结合，有望开发出糖蛋白相关的功能食品，开拓食品与人体营养相关联的领域。