一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用

本发明属于异麦芽酮糖醇的酶催化生产领域，具体涉及一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用。

背景技术：

1、当前，异麦芽酮糖醇依赖于传统化学酶法合成，即以蔗糖为原料，通过蔗糖异构酶（sucrose isomerase, siase）催化生成异麦芽酮糖及杂糖（如海藻酮糖），经除杂、脱色、浓缩、结晶等获得异麦芽酮糖晶体；然后再将异麦芽酮糖晶体溶解，在高温（140-200℃）、高压（8.5-10.0 mpa）、雷尼镍、加氢条件下还原为异麦芽酮糖醇；再经浓缩、结晶、粉碎、造粒等工艺获得异麦芽酮糖醇。由此可见，传统化学酶法制备异麦芽酮糖醇不仅要求高温、高压、加氢等危险性工艺，而且还存在过程繁杂、转化率低、环境污染和资源浪费等问题。

2、因此，亟待开发出一种新的低成本、低污染、较高产率的异麦芽酮糖醇的方法。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法。采用本发明方法，异麦芽酮糖醇得率高，步骤简捷，生产成本低，污染小，对环境影响小，可实现异麦芽酮糖醇的规模化生产。

2、本发明的另一目的在于提供所述多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法在生产异麦芽酮糖醇中的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法，包括以下步骤：以蔗糖为底物，利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇。

5、所述蔗糖异构酶（sisae）为来源于 pantoea dispersauq68j的siase，其编码基因序列如seq id no.1所示。

6、所述甘露醇脱氢酶（mdh）为来源于 pseudomonas fluorescens的甘露醇脱氢酶，其编码基因序列如seq id no.2所示；氨基酸序列如seq id no.4所示；

7、所述葡萄糖脱氢酶（gdh）为来源于 bacillus subtilis 168的葡萄糖脱氢酶，其编码基因序列如seq id no.3所示。

8、优选的，所述甘露醇脱氢酶还包括其突变体，所述突变体为如seq id no.4所示的甘露醇脱氢酶的氨基酸序列的第303位的his突变位ala，其他氨基酸残基保持不变。所述甘露醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.5所示；编码基因序列如seq id no.6所示。

9、所述催化反应为在缓冲溶液体系中进行催化反应，其中，

10、所述蔗糖的用量为按其在所述反应体系的终浓度为10~60 mmol/l添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为30~50 mmol/l添加计算，更优选为按其在所述反应体系的终浓度为50 mmol/l添加计算。

11、所述蔗糖异构酶的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0~10 u/ml添加计算（所述的酶的用量不为零）；优选为按其在所述反应体系的终浓度为1~10 u/ml添加计算；更优选为按其在所述反应体系的终浓度为1 u/ml添加计算。

12、所述甘露醇脱氢酶的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0~10 u/ml添加计算（所述的酶的用量不为零）；优选为按其在所述反应体系的终浓度为5~10 u/ml添加计算；更优选为按其在所述反应体系的终浓度为5 u/ml添加计算。

13、所述葡萄糖脱氢酶的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0~10 u/ml添加计算（所述的酶的用量不为零）；优选为按其在所述反应体系的终浓度为1~10 u/ml添加计算；更优选为按其在所述反应体系的终浓度为1 u/ml添加计算。

14、所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液在所述反应体系的终浓度为50~350 mmol/l；优选为100~200 mmol/l；更优选为100 mmol/l。

15、所述催化反应的ph为5.5~8.0；优选为6.0。

16、具体的，本发明所述催化反应的反应体系包括以下组分及其浓度：50~350 mmol/l磷酸盐缓冲液，2~5 mmol/l 金属离子，1~10 u/ml蔗糖异构酶，1~10 u/ml葡萄糖脱氢酶，1~10 u/ml甘露醇脱氢酶或其突变体，10~60 mmol/l蔗糖，ph为5.5~8.0。

17、优选的，所述催化反应的反应体系包括以下组分及其浓度：100 mmol/l 磷酸盐缓冲液，5 mmol/l 金属离子，1 u/ml蔗糖异构酶，1 u/ml葡萄糖脱氢酶，5 u/ml甘露醇脱氢酶或其突变体，50 mmol/l蔗糖，ph为6.0。

18、所述金属离子为mg2+，ca2+，fe2+，co2+，cu2+和mn2+中的至少一种。优选为mg2+和fe2+中的至少一种；更优选为mg2+。

19、所述催化反应的温度为20~50℃，优选为30℃。

20、所述催化反应的时间为50~100 h，优选为66 h。

21、本发明以蔗糖为底物，加入蔗糖异构酶，葡萄糖脱氢酶，甘露醇脱氢酶配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由蔗糖异构酶将蔗糖转化为异麦芽酮糖；由甘露醇脱氢酶将异麦芽酮糖转化为异麦芽酮糖醇，由葡萄糖脱氢酶将nadh转化为nad+，供上述步骤循环使用nad+。整个反应是放热反应，即在热力学上是行得通的，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率。

22、另外，通过向上述反应体系中添加nadh和葡萄糖，可以提搞甘露醇脱氢酶的转化率。

23、本发明具有以下有益效果：

24、（1）本发明所公开的异麦芽酮糖醇的制备方法以来源广泛的蔗糖为底物，在一个多酶反应体系中，通过体外多酶高效催化将底物转化为异麦芽酮糖醇。本发明在异麦芽酮糖醇体外合成途径中，各个酶的比活不同，作用强度也不同，通过优化各个酶的最佳比例来提高催化效率，即通过过程优化，添加能够利用蔗糖的酶，从而建立优化的多酶体系，可以显著提高原料的转化效率和异麦芽酮糖醇的得率，较高得率和较高转化率又大大降低异麦芽酮糖醇的分离成本。

25、（2）本发明还对甘露醇脱氢酶进行了改造以提高异麦芽酮糖醇的得率。结果发现，将甘露醇脱氢酶氨基酸序列的第303位的his突变位ala，其他氨基酸残基保持不变，得到的甘露醇脱氢酶突变体能显著提高异麦芽酮糖醇的得率。在相同的反应体系条件下，使用甘露醇脱氢酶突变体，异麦芽酮糖醇的终浓度为7.9 mm，蔗糖原子转化率达到79%，远高于使用未改造的甘露醇脱氢酶的效果（异麦芽酮糖醇的终浓度为6.5 mm，蔗糖原子转化率达到65%）。

26、（3）本发明方法原料利用率高，异麦芽酮糖醇转化率较高，即异麦芽酮糖醇得率高，步骤简捷，生产成本低，污染小，对环境影响小，可实现异麦芽酮糖醇的规模化生产。