一种检测牛肉质相关基因表达的探针组合、芯片及方法与流程

本发明涉及分子检测及基因芯片技术，特别是涉及一种检测牛肉质相关基因表达的探针组合、芯片及方法，属于基因工程领域。

背景技术：

1、我国肉牛养殖业一个比较突出的问题是牛肉品质普遍一般，高档牛肉生产能力不足。

2、牛的肉质性状属于多基因控制性状，牛肉的脂肪含量是合成水平和分解水平综合作用的结果。其中，脂肪酸合成酶(fas)和乙酰辅酶a羧化酶(acaca)是脂肪酸合成的限速酶；甘油三酯脂肪酶(pnpla2)是甘油三酯水解的限速酶；激素敏感性脂肪酶(lipe)和甘油单酯脂肪酶(mgll)也参与脂肪的分解代谢。

3、维生素是酶的辅酶因子，其中维生素a是一种重要的促进脂肪合成的调控因素，它在体内是通过视黄醇、视黄醛和视黄酸为代谢产物促进脂肪的形成，而且在成脂定型、成脂分化和脂肪蓄积阶段都发挥重要作用。

4、维生素a主要是通过对zfp423基因、pparg基因、c/ebp基因的调控发挥作用。其中，zfp423基因是祖细胞成脂定型转录因子，是脂肪细胞数量增殖的关键因子；过氧化物酶体pparg基因是脂肪分化的必需转录因子，是脂肪细胞肥大的关键因子，shh信号是pparg的负调控因子；ccaat增强子结合蛋白c/ebp基因是脂肪形成的早期阶段关键调控因子；在脂肪的蓄积阶段，固醇调节结合元件srebp-1c基因是关键调控因子。

5、维生素a及其衍生物在体内的作用是靠其相应的受体实现的。其中，视黄醇受体为rars，视黄酸受体为rxrs。pparg与视黄酸受体rxrs形成异二聚体，调节脂肪的细胞分化。维生素d受体(vdr)与pparg竞争结合类视黄醇x受体(rxr)。较高的vdr/rxr结合可以减少pparg/rxr异二聚体的形成，从而抑制脂肪的生成。

6、因此，肉质性状作为一个多基因性状，在实践中往往需要进行多基因检测。

7、目前，肉质多基因检测以高通量测序技术(ngs技术)或者实时荧光定量pcr技术为主，活体条件下的动物肌肉脂肪含量通常以超声波技术进行间接测定。

8、然而，ngs技术依赖于大型的基因测序仪、专业的文库构建人员和生物信息人员。实时荧光定量pcr技术整个过程包括采样、rna提取、rna质量检测、cdna合成、定量pcr多个步骤，操作过程繁琐，对实验人员的技术经验要求较高。同时，目前商品化的牛肉质多基因表达检测试剂盒非常缺乏，基于多基因表达数据对肉质预期的评估方法同样非常缺乏。

9、虽然，活体情况下牛肉肌间脂肪可以间接性地通过b超进行测量。但是，采用b超测量并不能清楚地反映出牛肉质特征与基因表达特征之间的基本情况和关系。

10、因此，对牛肉质基因的监测十分重要，广大肉牛养殖企业以及广大农民养殖户非常需要一些便捷、低价、有效的能够辅助肉牛生长以及牛肉品质改善的措施。而对于广大农村地区而言，没有基因测序仪、定量pcr仪这一类基因检测设备，农村地区的基因检测需求更多的是通过基因芯片产品来解决。

11、此外，目前市场上没有商业化的牛肉质多基因检测试剂盒，个别的单基因检测试剂盒多为定量pcr试剂盒。虽然，基因表达芯片和定量pcr技术都属于基因表达检测技术。但是，一般情况下，定量pcr所使用的探针不能直接用于基因芯片技术中。

12、对于集成电路芯片而言，我国的瓶颈主要在于制造。但是，对于基因芯片而言，目前的瓶颈主要在于设计。设计方面的瓶颈又可以细分为：

13、1)基因与生物性状的关系十分复杂，确定目的性状相关基因和位点难度大；

14、2)对于多基因表达检测，选取同时满足多基因表达检测的探针组合很难。主要原因是rna稳定性差，具有剪接产生的丰富异质性，rna表达具有较宽的范围。

15、除了基因芯片设计方面的难度，对于基因表达芯片的商业化产品，如何选择基因组合也一直是一个难题。此外，多基因检测产品的数据利用方法和解释也一直存在各种各样的问题。

16、由此可知，广大肉牛养殖企业以及广大农民养殖户迫切需要一种便捷、低价、高效的对牛肉质相关基因进行检测的基因芯片和检测方法。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中存在的缺陷，利用dna聚合酶合成技术，通过dna聚合酶将牛肉质基因的rna信息转换为探针的延伸链序列，所有的检测环节在一个芯片上即可实现，能够完成检测的自动化，一步完成牛肉质相关基因表达水平的检测。

2、为此，本发明一方面提供了一种用于检测牛肉质相关基因表达的探针组合，其包含第1-14组探针，其中第1组由seq id no.1-2所示的探针组成，第2组由seq id no.3-4所示的探针组成，第3组由seq id no.5-6所示的探针组成，第4组由seq id no.7-8所示的探针组成，第5组由seq id no.9-10所示的探针组成，第6组由seq id no.11-12所示的探针组成，第7组由seq id no.13-14所示的探针组成，第8组由seq id no.15-16所示的探针组成，第9组由seq id no.17-18所示的探针组成，第10组由seq id no.19-20所示的探针组成，第11组由seq id no.21-22所示的探针组成，第12组由seq id no.23-24所示的探针组成，第13组由seq id no.25-26所示的探针组成，第14组由seq id no.27-28所示的探针组成。

3、在本发明优选的实施方案中，本发明所述的探针组合由第1-14组探针组成。

4、本发明另一方面提供了本发明所述的探针组合在制备基因芯片中的应用。

5、本发明另一方面提供了一种用于检测牛肉质相关基因表达的基因芯片，其上固定有本发明所述的探针组合，每一探针通过连接臂和氨基与基因芯片的基片连接。

6、在本发明优选的实施方案中，本发明所述的基因芯片为盒装芯片。

7、本发明另一方面提供了一种定性检测牛肉质相关基因表达的方法，采用本发明所述的探针组合或者采用本发明所述的基因芯片，在dna聚合酶的作用下，通过dna聚合酶将牛肉质基因的rna信息转换为探针的延伸链序列，完成牛肉质相关基因的识别和检测。

8、在本发明优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

9、1、探针的设计和合成；

10、2、芯片的制备；

11、3、基因表达的检测；

12、其中，在步骤3中，在延伸反应中使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷三磷酸(edu)替代胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸(dttp)，通过click反应进行延伸链序列中edu的荧光标记，清洗后进行荧光检测。

13、本发明另一方面提供了一种检测牛肉质相关基因相对表达值的方法，其在本发明所述的定性检测牛肉质相关基因表达的方法的基础上，增加了对相关基因的相对表达值进行计算的步骤，具体为：

14、提取目的基因的灰度值与内参基因(actb基因和gapdh基因)的灰度值；

15、以相对actb和gapdh两个内参基因的相对表达值的平均数，按照如下公式，以灰度值的比值计算目的基因的相对表达值：

16、基因的相对表达值＝(目的基因的灰度值/actb基因的灰度值+目的基因的灰度值/gapdh基因的灰度值)/2。

17、本发明再一方面提供了本发明所检测的牛肉质相关基因，其包括与脂肪合成相关的基因，与脂肪分解相关的基因，与脂肪细胞增殖相关的基因，与脂肪细胞肥大相关的基因，脂肪合成的负调控基因，与脂肪代谢过程的辅酶因子受体相关的基因。

18、在本发明优选的实施方案中，与脂肪合成相关的基因选自fas基因、acaca基因；与脂肪分解相关的基因选自pnpla2基因、mgll基因；与脂肪细胞肥大相关的基因为pparg基因；脂肪合成的负调控基因为shh基因；与脂肪代谢过程的辅酶因子受体相关的基因选自vdr基因、rxra基因。

19、本发明通过采用上述技术方案，获得了以下的有益效果：

20、1、与现有技术相比，本发明设计的探针的tm值控制在65℃至68℃，多数集中在66℃至68℃附近，保证了多个基因在同一pcr程序下能够同时扩增。

21、2、本发明设计的检测牛肉质相关基因表达的芯片保证了可以在一块芯片上同时进行多个基因小样本的快速检测，对于牛肉质相关基因的表达筛查非常方便，实现了低成本的多次筛查，可以及时发现牛肉质基因表达变化。

22、3、本发明将5-乙炔基-2'-脱氧尿苷三磷酸(edu)整合到探针延伸链中，标记稳定且可以定量分析，克服了传统定量pcr中每次扩增都需要进行荧光检测的不便，在反应结束后一次获取信号，能够有效缩短检测时间。

23、4、与现有的检测基因仅有一个座位的试剂盒相比，本发明的基因芯片对肉质相关基因的度量具有较高的系统性，既含有与脂肪合成相关的基因，又有与脂肪分解相关的基因。从脂肪形成的时间上，即含有脂肪细胞增殖的关键基因，又包括脂肪细胞肥大的关键基因。此外，本发明的基因芯片还包括脂肪合成的负调控基因与脂肪代谢过程的辅酶因子受体基因。因此，本发明可以对牛肉质相关性状的微观机制提供更加全面的分析。