靶向滑膜肉瘤SYT-SSX融合突变的TCR-T细胞、TCR分子及制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程及免疫治疗，具体涉及靶向滑膜肉瘤syt-ssx融合突变的tcr-t细胞、tcr分子及制备方法和应用。

背景技术：

1、tcr-t细胞疗法，即细胞受体基因工程改造的t细胞疗法，是向正常外周血淋巴细胞上导入已知的抗原特异性tcr(t cell receptor)基因而进行治疗的一种疗法。普通t细胞中引入新的基因，使得改造过的t细胞能够表达有效识别肿瘤细胞的tcr，从而引导t细胞特异性杀死肿瘤细胞。tcr是t细胞表面的特异性受体，是高度多样化的异源二聚体，大多数是由两条不同肽链构成的异二聚体(α和β链)，每条肽链又可分为可变区(v区)，恒定区(c区)。每个tcr链包含三个高可变环区，称之为互补决定区cdr1-3(complementaritydetermining regions，cdr)。cdr3由v和j或d和j之间连接区编码，cdr3变异程度较大。由于cdr3是与抗原直接接触的tcr区域，因此cdr3在tcr与肽-mhc复合物的相互作用中的特异性起到了决定性的作用。tcr以非共价键形式与cd3结合，形成tcr-cd3复合物。后者通过识别并结合主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)递呈的抗原，激活t细胞，释放γ-干扰素(ifn-γ)、颗粒酶b等。

2、tcr-t细胞介导的肿瘤靶向杀伤功能极度依赖于肿瘤抗原表达的特异性。在肿瘤细胞中，基因突变(包括点突变、移码突变、缺失突变以及融合突变等)所引起的氨基酸序列变异产生的肿瘤新抗原(neoantigen)，是肿瘤特异性抗原的主要来源。然而，由于肿瘤突变的随机性，导致个体差异大，因此找寻共享型新抗原，对于抗原特异性tcr-t细胞免疫治疗的发展与临床转化至关重要。

3、滑膜肉瘤(synovial sarcoma，ss)是一种罕见但侵袭性极强的恶性肿瘤，起源于间充质干细胞、肌肉组织或神经组织，约占所有软组织肉瘤的5％-10％。在分子遗传学上，滑膜肉瘤具有明确的遗传病理学特征，95％以上的患者存在特征性染色体易位(x；18)(p11.2；q11.2)，滑膜肉瘤常染色体易位基因(synovial sarcoma translocation，syt)和滑膜肉瘤x染色体断点基因(synovial sarcoma x chromosome breakpoint，ssx)(包括ssx1、ssx2、ssx4)，形成syt-ssx融合基因。融合突变产生的肿瘤新抗原相较于点突变同源性更低，因此其免疫原性更高，而syt-ssx融合突变所产生的肿瘤新抗原在滑膜肉瘤患者中高度共享，是tcr-t细胞治疗的理想抗原。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种靶向滑膜肉瘤syt-ssx融合突变的tcr-t细胞、tcr分子及制备方法和应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种tcr分子，所述的tcr分子能够特异性结合syt-ssx融合突变肽/hla复合物，所述的tcr分子含有α链cdr3、β链cdr3或二者的组合；α链cdr3功能片段的氨基酸序列如seqid no：1、5或9所示；β链cdr3功能片段的氨基酸序列如seq id no：2、6或10所示。

4、α链cdr3全长的氨基酸序列如seq id no：3、7或11所示；β链cdr3全长的氨基酸序列如seq id no：4、8或12所示。

5、本发明还保护上述的tcr分子的融合蛋白或其化学衍生物的融合物。

6、本发明还保护上述的tcr分子以简并核酸密码为基础的变体但编码相同氨基酸序列。

7、本发明还涉及编码上述的tcr分子的全长或者其功能片段的基因。

8、作为另一个重要的技术方案，本发明还提供一种tcr-t细胞，所述的tcr-t细胞携带上述的tcr分子。

9、为优化上述技术方案，采取的具体限定还包括：

10、所述的tcr-t细胞中的t细胞来源为以下细胞的至少一种：

11、a)健康人或者患者自身pbmc外周血中单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，pbmc)来源的一个或多个t细胞；

12、b)诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ipsc)来源的体外定向分化的一个或多个t细胞。

13、其中，所述的t细胞选自cd4+t细胞、cd8+t细胞和γδt细胞。

14、本发明还提供上述的tcr分子的制备方法，包括以下步骤：

15、步骤(1)：预测针对hla分子的共享抗原肽段序列，得到潜在抗原肽段；

16、步骤(2)：以潜在抗原肽段为目标进行体外合成，得到抗原肽段；

17、步骤(3)：运用合成的抗原肽段进行体外快速诱导syt-ssx融合突变肽特异性t细胞，并进行抗原特异性t细胞免疫反应功能验证；

18、步骤(4)：进行转录组单细胞测序，通过生信分析，获得潜在抗原肽段的tcr分子序列。

19、为优化上述技术方案，采取的具体限定还包括：

20、采用的hla分子包括hla-a*0201、hla-a*2402以及hla-a*1101三种亚型。

21、本发明还保护上述的tcr-t细胞在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

22、在本发明的研究过程中，通过比对syt-ssx1融合蛋白、syt-ssx2融合蛋白以及sty-ssx4融合蛋白序列，从中找寻共享融合突变肽段，利用netmhcpan4.0软件平台，针对中国人群占比较多的hla-a*0201、hla-a*2402以及hla-a*1101三种亚型，预测共享融合突变肽段的潜在结合位点，获取了与hla分子亲和力强的候选新抗原肽段的序列信息以及与之对应的hla分子亚型。

23、其中，抗原肽段体外合成后通过高效液相色谱纯化至纯度>95％。

24、本发明提供的诱导策略如下：day0，将分离得到的外周血中单个核细胞进行铺板，加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-α2a诱导dc细胞分化；day2，加入lps、resiquimod诱导dc细胞成熟；day4，加入候选抗原肽段进行dc细胞抗原负载，从而诱导抗原特异性t细胞激活；day6，半量换液培养，添加il-7维持培养，10-14天出现克隆型扩增。

25、本发明在抗原反应性t细胞验证中，综合运用elispot、cba等方法检测t细胞激活情况，通过流式分析t细胞活化指标cd137表达情况，从而筛选出可以引起抗原特异性激活t细胞的抗原肽信息以及对应hla分子分型。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

27、1、本发明建立了抗原反应性t细胞快速诱导策略，建立了依赖单细胞测序、综合分析单细胞转录组与t细胞受体序列信息的高效tcr筛选策略；

28、2、本发明发现并鉴定了syt-ssx融合突变共享新抗原肽段信息，及其对应的互作hla分子信息；

29、3、本发明发现了特异性识别syt-ssx融合突变共享新抗原的tcr序列信息；

30、4、本发明提供了可以特异性识别syt-ssx融合突变共享新抗原的tcr-t细胞，有效应用于治疗hla-a*2402阳性、syt-ssx融合突变阳性滑膜肉瘤，具有显著的治疗效果。