一种用于合成稳定PolyA尾巴的载体及其制备方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种用于合成稳定polya尾巴的载体及其制备方法。

背景技术：

1、质粒模板制备是合成mrna技术中最上游的部分，一个好的质粒模板对于体外转录合成反应合成mrna的产量和纯度以及体内表达效果是至关重要的。

2、在mrna体外转录合成中，普遍通过质粒模板共转录的方式来添加ploya尾巴，ploya尾巴可以稳定mrna，防止其发生降解，对于mrna的制备发挥着至关重要的作用。polya尾巴添加方式有2种：一种是酶法合成，mrna转录完成后，通过源自大肠杆菌的polya聚合酶添加；一种是共转录，由已经存在于模板质粒dna或者pcr产物上的polya尾巴直接转录形成。常规模板质粒上构建的a尾一般是连续的120个a，但在质粒发酵生产中质粒序列上的polya尾巴经常会发生碱基丢失，造成尾巴缩短，无法实现生产的质粒polya尾巴的均一性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于合成稳定polya尾巴的载体及其制备方法，以解决以下技术问题：防止模板质粒上构建的polya尾巴发生碱基丢失，提高质粒中polya尾在发酵、传代的过程的稳定性。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种用于合成稳定polya尾巴的载体，所述载体为30a-l-70a载体、120a载体中任意一种，所述30a-l-70a载体的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述120a载体的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、作为本发明的进一步方案，所述用于快速合成polya基因的载体的制备方法，包括如下制备步骤：

5、步骤一：分段构建载体：分别构建前载体、后60a载体；

6、所述前载体为30a+10bp+10a载体、前60a载体中任意一种；

7、所述30a+10bp+10a载体的核苷酸序列如seq id no.3所示；

8、所述前60a载体的核苷酸序列如seq id no.4所示；

9、所述后60a载体的核苷酸序列如seq id no.5所示；

10、步骤二：切连获得重组载体：将前载体、后60a载体分别通过bsai酶进行酶切并回收得前载体的酶切片段、后60a载体的酶切片段后，将前载体的酶切片段、后60a载体的酶切片段通过t4酶连接，得重组载体；

11、步骤三：原核表达筛选出正确的优化前重组载体：将重组载体转化入大肠杆菌感受态细胞后，涂平板培养16-20h后，挑取平板上的单克隆进行菌落pcr，阳性克隆送测序，筛选出正确的优化前重组载体；

12、步骤四：加入发卡结构：将pkbf载体进行pcr后pkbf载体的pcr产物；得将优化前重组载体采用hindiii和aatii进行酶切后与pkbf载体的pcr产物重组，转化入大肠杆菌感受态细胞后，复苏1h，涂平板培养16-20h后，挑取平板上的单克隆进行菌落pcr，阳性克隆送测序，筛选出正确的优化后重组载体。

13、本发明优化前30a-l-70a和优化前120a载体的线性化位点为bsmbi，也可将线性化位点变为bspqi，其余构建步骤均相同，也可实现相同功能。

14、作为本发明的进一步方案，所述30a+10bp+10a载体包括如下步骤构建：

15、步骤a1：设计合成长退火引物；

16、步骤a2：pcr扩增pkbf载体并胶回收扩增产物，得pkbf载体的pcr产物；

17、步骤a3：将长退火引物与pkbf载体的pcr产物进行重组反应，得重组产物一；

18、步骤a4：将重组产物一转化入大肠杆菌感受态细胞后，涂平板培养16-20h后，挑取平板上的单克隆进行菌落pcr，阳性克隆送测序，筛选出正确的30a+10bp+10a载体。

19、作为本发明的进一步方案，所述长退火引物的序列包括如下顺序的连续的碱基序列：30个连续的a碱基、10bp不连续碱基、10个连续的a碱基；所述长退火引物包括iis类限制性内切酶酶切位点；所述iis类限制性内切酶酶切位点与bsai的酶切位点相同。

20、作为本发明的进一步方案，所述前60a载体与后所述60a载体的构建步骤相同，所述前60a载体包括如下步骤构建：

21、步骤b1：设计合成overlap pcr引物；

22、步骤b2：pcr扩增pbbf载体并胶回收扩增产物，得pbbf载体的pcr产物；

23、步骤b3：将overlap pcr引物与pbbf载体的pcr产物进行重组反应，得重组产物二；

24、步骤b4：将重组产物二转化入大肠杆菌感受态细胞后，涂平板培养16-20h后，挑取平板上的单克隆进行菌落pcr，阳性克隆送测序，筛选出正确的前60a载体。

25、作为本发明的进一步方案，所述overlap pcr引物包括60个连续的a碱基序列；所述overlap pcr引物包括iis类限制性内切酶酶切位点；所述iis类限制性内切酶酶切位点与bsai的酶切位点相同。

26、作为本发明的进一步方案，所述pbbf载体的核苷酸序列如seq id no.6所示。

27、作为本发明的进一步方案，步骤三所述正确的优化前重组载体包括优化前30a-l-70a载体、优化前120a载体；所述优化前30a-l-70a载体的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述优化前120a载体的核苷酸序列如seq id no.8所示。

28、作为本发明的进一步方案，步骤四所述pkbf载体的核苷酸序列如seq id no.9所示。

29、作为本发明的进一步方案，步骤四所述pkbf载体的pcr引物包括pkbf-f引物、pkbf-r引物；

30、所述pkbf-f引物的核苷酸序列如seq id no.10所示，具体序列如下：tgtcatgataataatggtttcttagacgtcgcctggggtgcctaatgagtgagctaactc；

31、所述pkbf-r引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，具体序列如下：

32、cgtcgactgcagaggcctgcatgcaagctttcagtacaatctgctctgatgccgcatagt。

33、本发明的有益效果：

34、本发明从载体元件优化、构建专属载体入手，通过设计长退火引物获得带有polya的片段，分段构建不同长度的polya载体：30a+10bp+10a载体/前60a载体、后60a载体，再通过酶切、连接的方式，获得重组载体—不连续的110个a尾/连续的120个a尾载体，最后在polya尾两端加入相同的一段发卡结构，得优化后30a-l-70a载体/优化后120a载体，一方面优化后30a-l-70a载体/优化后120a载体通过引入bsai酶切位点，基因合成过程中可直接将目的基因通过酶切、连接的方式构建到优化后30a-l-70a载体/优化后120a载体中，可省略从头合成的繁琐步骤，快速的获得带有polya尾的载体，极大地节约了生产时间和成本；另一方面载体中polya尾在发酵、传代的过程中的稳定性较好，摇菌传代15次后a尾个数不会出现大量丢失现象；同时发卡结构使优化后重组载体在后续使用过程中更加稳定，a尾正确克隆率可达85％以上。