一种用于鉴定体液来源的三重RT-qPCR体系的制作方法

本发明属于法医学领域，具体涉及一种用于鉴定体液来源的三重rt-qpcr体系。

背景技术：

1、体液鉴别是法医学中的一个重要课题，它可以为犯罪现场重建、嫌疑人排除、受害者辨认等提供重要的线索和证据。microrna(mirna)凭借其高度稳定性及组织特异性等优点逐渐被广泛应用于法医体液鉴别，越来越多的体液特异性mirna被筛选和验证。

2、犯罪现场中常见的体液类型主要包括外周血(peripheral blood，pb)、月经血(menstrual blood，mb)、唾液(saliva，sa)、精液(semen，se)、阴道分泌物(vaginalsecretion，va)。要实现对未知体液的准确鉴别，往往需要该检材中多个mirna标记的数据，即需要对该检材进行多次rt-qpcr检测。同时实际犯罪现场中提取到的检材往往是微量的，对多个标记检测时需要进行检材的等分或者稀释，一定程度上会降低检测方法的灵敏度。此外，并行多个单重检测会成倍的增加工作量、各项成本以及错误风险，不利于将鉴别方法真正意义的应用到法医实践中。基于以上原因，亟需建立准确和快速对mirna进行检测的多重实时荧光定量pcr检测体系。

技术实现思路

1、本发明的目的为鉴定待测体液为外周血、月经血、精液、唾液还是阴道分泌液。

2、本发明首先保护用于鉴定体液来源的成套试剂；所述体液来源为外周血、月经血、精液、唾液或阴道分泌液。本发明所保护的用于鉴定体液来源的成套试剂可包括成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3、成套试剂4和成套试剂5；

3、所述成套试剂1可包括逆转录引物mir-451a-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-451a-r和荧光探针mir-451a-p；

4、所述成套试剂2可包括逆转录引物mir-891a-5p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-891a-5p-r和荧光探针mir-891a-5p-p；

5、所述成套试剂3可包括逆转录引物mir-203a-3p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-203a-3p-r和荧光探针mir-203a-3p-p；

6、所述成套试剂4可包括逆转录引物mir-223-3p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-223-3p-r和荧光探针mir-223-3p-p；

7、所述成套试剂5可包括逆转录引物mir-320a-3p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-320a-3p-r和荧光探针mir-320a-3p-p。

8、所述逆转录引物mir-451a-rt可为seq id no:6所示的单链dna分子。

9、所述通用正向引物f可为seq id no:7所示的单链dna分子。

10、所述特异性反向引物mir-451a-r可为seq id no:8所示的单链dna分子。

11、所述荧光探针mir-451a-p可为seq id no:9所示的单链dna分子。

12、所述逆转录引物mir-891a-5p-rt可为seq id no:10所示的单链dna分子。

13、所述特异性反向引物mir-891a-5p-r可为seq id no:11所示的单链dna分子。

14、所述荧光探针mir-891a-5p-p可为seq id no:12所示的单链dna分子。

15、所述逆转录引物mir-203a-3p-rt可为seq id no:13所示的单链dna分子。

16、所述特异性反向引物mir-203a-3p-r可为seq id no:14所示的单链dna分子。

17、所述荧光探针mir-203a-3p-p可为seq id no:15所示的单链dna分子。

18、所述逆转录引物mir-223-3p-rt可为seq id no:16所示的单链dna分子。

19、所述特异性反向引物mir-223-3p-r可为seq id no:17所示的单链dna分子。

20、所述荧光探针mir-223-3p-p可为seq id no:18所示的单链dna分子。

21、所述逆转录引物mir-320a-3p-rt可为seq id no:19所示的单链dna分子。

22、所述特异性反向引物mir-320a-3p-r可为seq id no:20所示的单链dna分子。

23、所述荧光探针mir-320a-3p-p可为seq id no:21所示的单链dna分子。

24、所述用于鉴定体液来源的成套试剂具体可由成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3、成套试剂4和成套试剂5组成。

25、所述成套试剂1具体可由逆转录引物mir-451a-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-451a-r和荧光探针mir-451a-p组成。

26、所述成套试剂2具体可由逆转录引物mir-891a-5p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-891a-5p-r和荧光探针mir-891a-5p-p组成。

27、所述成套试剂3具体可由逆转录引物mir-203a-3p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-203a-3p-r和荧光探针mir-203a-3p-p组成。

28、所述成套试剂4具体可由逆转录引物mir-223-3p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-223-3p-r和荧光探针mir-223-3p-p组成。

29、所述成套试剂5具体可由逆转录引物mir-320a-3p-rt、通用正向引物f、特异性反向引物mir-320a-3p-r和荧光探针mir-320a-3p-p组成。

30、上述成套试剂中，所述荧光探针mir-451a-p、所述荧光探针mir-891a-5p-p、所述荧光探针mir-203a-3p-p、所述荧光探针mir-223-3p-p和所述荧光探针mir-320a-3p-p的一端均用荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。

31、上述成套试剂中，所述荧光探针mir-451a-p、所述荧光探针mir-203a-3p-p和所述荧光探针mir-320a-3p-p的荧光标记不同。所述荧光探针mir-891a-5p-p、所述荧光探针mir-223-3p-p和所述荧光探针mir-320a-3p-p的荧光标记不同。

32、本发明还保护一种用于鉴定体液来源的体系，可包括同时逆转录反应体系、三重qpcr反应体系1和三重qpcr反应体系2；

33、所述同时逆转录反应体系包括上述任一所述逆转录引物mir-451a-rt、上述任一所述逆转录引物mir-891a-5p-rt、上述任一所述逆转录引物mir-203a-3p-rt、上述任一所述逆转录引物mir-223-3p-rt和上述任一所述逆转录引物mir-320a-3p-rt；

34、三重qpcr反应体系1包括上述任一所述通用正向引物f、上述任一所述特异性反向引物mir-451a-r、上述任一所述荧光探针mir-451a-p、上述任一所述特异性反向引物mir-203a-3p-r、上述任一所述荧光探针mir-203a-3p-p、上述任一所述特异性反向引物mir-320a-3p-r和上述任一所述荧光探针mir-320a-3p-p；

35、三重qpcr反应体系2包括上述任一所述通用正向引物f、上述任一所述特异性反向引物mir-891a-5p-r、上述任一所述荧光探针mir-891a-5p-p、上述任一所述特异性反向引物mir-223-3p-r、上述任一所述荧光探针mir-223-3p-p、上述任一所述特异性反向引物mir-320a-3p-r和上述任一所述荧光探针mir-320a-3p-p。

36、上述同时逆转录反应体系中，所述逆转录引物mir-451a-rt、所述逆转录引物mir-891a-5p-rt、所述逆转录引物mir-203a-3p-rt、所述逆转录引物mir-223-3p-rt和所述逆转录引物mir-320a-3p-rt在同时逆转录反应体系中的浓度为5-80nm(如5-10nm、10-20nm、20-40nm、40-80nm、5nm、10nm、20nm、40nm或80nm)。

37、上述三重qpcr反应体系1中，所述通用正向引物f、所述特异性反向引物mir-451a-r、所述荧光探针mir-451a-p、所述特异性反向引物mir-203a-3p-r、所述荧光探针mir-203a-3p-p、所述特异性反向引物mir-320a-3p-r和所述荧光探针mir-320a-3p-p在三重qpcr反应体系1中的浓度依次可为1200nm、400nm、300nm、400nm、300nm、400nm和300nm。

38、上述三重qpcr反应体系2中，所述通用正向引物f、所述特异性反向引物mir-891a-5p-r、所述荧光探针mir-891a-5p-p、所述特异性反向引物mir-223-3p-r、所述荧光探针mir-223-3p-p、所述特异性反向引物mir-320a-3p-r和所述荧光探针mir-320a-3p-p在三重qpcr反应体系2中的浓度依次可为1200nm、400nm、300nm、400nm、300nm、400nm和300nm。

39、优选的，适用于三重rt-qpcr反应的同时逆转录反应体系见实施例中的表4。

40、优选的，三重qpcr反应体系1的最佳体系见实施例中的表5。

41、优选的，三重qpcr反应体系2的最佳体系见实施例中的表6。

42、进行三重qpcr的最佳反应条件可为：95℃20s；40次热循环(95℃1s、60℃20s)。

43、优选的，进行三重qpcr的最佳退火温度可为60℃。

44、本发明还保护含有上述任一所述成套试剂的试剂盒。

45、本发明还保护上述任一所述用于鉴定体液来源的体系或上述任一所述试剂盒的制备方法，可包括将上述任一所述成套试剂中的各条引物和探针单独包装的步骤。

46、本发明还保护上述任一所述成套试剂、上述任一所述用于鉴定体液来源的体系或上述任一所述试剂盒在鉴定体液来源中的应用；所述体液来源为月经血、外周血、唾液、精液或阴道分泌物。

47、本发明还保护一种鉴定待测体液为外周血、月经血、精液、唾液还是阴道分泌液的方法，包括如下步骤：

48、(1)取待测体液的rna，采用上述任一所述同时逆转录反应体系进行反转录，得到待测体液的cdna；

49、(2)以待测体液的cdna为模板，采用上述任一所述三重qpcr反应体系1进行qpcr，从而得到mir-451a的△cq值和mir-203a-3p的△cq值；以待测体液的cdna为模板，采用上述任一所述三重qpcr反应体系2进行qpcr，从而得到mir-891a-5p的△cq值和mir-223-3p的△cq值；

50、(3)完成步骤(2)后，将mir-451a的△cq值、mir-203a-3p的△cq值、mir-891a-5p的△cq值和mir-223-3p的△cq值输入kde模型，kde模型经过计算输出待测体液为外周血、月经血、精液、唾液还是阴道分泌液。

51、上述方法中，kde模型经过计算还可以输出待测体液的预测概率。

52、上述方法中，所述kde模型为建立方法可如下：

53、(a1)分别取若干个外周血样本、若干个月经血样本、若干个精液样本、若干个唾液样本和若干个阴道分泌液样本的rna，采用上述任一所述同时逆转录反应体系进行反转录，得到cdna；

54、(a2)分别以步骤(a1)得到的cdna为模板，采用上述任一所述三重qpcr反应体系1进行qpcr，从而得到mir-451a的△cq值和mir-203a-3p的△cq值；以待测体液的cdna为模板，采用上述任一所述三重qpcr反应体系2进行qpcr，从而得到mir-891a-5p的△cq值和mir-223-3p的△cq值；

55、(a3)采用kde机器学习算法将步骤(a2)得到的△cq值构建kde模型。

56、上述方法中，采用kde机器学习算法将步骤(a2)得到的△cq值构建kde模型具体可参考文献(yang liu，hongxia he，zhi-xiong xiao，anquan ji，jianye，qifan sunandyang cao.a systematic analysis of mirna markers and classificationalgorithms for forensic body fluid identification.briefings inbioinformatics，00(00)，2020，1-9)中记载的方法进行。

57、本技术的发明人依据实验室前期所筛选的体液特异性mirna(mir-451a、mir-891a-5p、mir-203a-3p和mir-223-3p)以及内参基因mir-320a-3p，建立了可同时定量包括内参基因在内的3种mirna的三重rt-qpcr检测体系。结果表明，该检测体系具有良好的抗干扰性、灵敏度和重复性，大大节省了实验时间和样本消耗，通过实际样本检测数据建立的体液预测模型可以100％区分五种常见的体液，为mirna体液鉴定方法应用于法医实践提供了可行方案。本发明具有重要的应用价值。