一种表达载体、OsSUT1基因的用途和转基因水稻

本发明涉及生物领域，具体为一种表达载体、 ossut1基因的用途和转基因水稻。

背景技术：

1、本技术人在先提出了一项发明专利cn114703221a公开了一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的 poshak1:osfln2表达载体及其应用。采用受干旱/渗透胁迫诱导上调表达的基因 oshak1的启动子，驱动编码果糖激酶类似蛋白基因 osfln2在水稻中表达，发现干旱胁迫下， poshak1:osfln2促进体内糖分的合成和运输，并显著提高植株的抗旱性。所述 poshak1:osfln2转基因株系在对照条件下正常生长，没有出现不利的表型，而peg处理后，糖代谢指标pn、sps、ser均显著高于wt，这与 osfln2在干旱胁迫下的诱导表达密切相关，并且在t1代和t2代稳定遗传。

2、在该案中， osfln2为果糖激酶类似蛋白基因， oshak1为受干旱/渗透胁迫诱导上调表达的基因；

3、对于本领域技术人员来说，验证植物响应干旱胁迫的相关表现为：

4、1.干旱胁迫影响水稻糖分代谢，包括但不限于：叶片的净光合速率、sps活性和蔗糖外运速率（蔗糖从源到库的转运）；

5、2.干旱对植株地上部和根系生长的抑制；

6、3.干旱对糖分合成关键酶sps的活性的影响；

7、4.干旱对水稻持水能力和脂质过氧化程度的影响；

8、5.干旱对衰老、胁迫响应基因表达的影响；

9、以及其他未提及的因素。

10、关于水稻干旱的转基因应对方式，还可以参考如下方案：

11、现有技术1：cn116121266a公开了水稻基因 qss7在抗旱中的应用，阐述了维管相关蛋白qss7的抗旱用途；

12、现有技术2：cn116121293a公开了 nrt2.1基因在提高作物抗干旱和/或抗高温性能中的应用，阐述了硝酸盐转运蛋白nrt2.1的抗旱用途；

13、现有技术3：cn115851660a公开了蛋白ospis及编码基因在提高植物抗逆性中的应用，阐述了水稻磷脂酰肌醇合酶基因 ospis的抗旱用途；

14、现有技术4：cn116218897a公开了 osgols2基因在提高水稻种子活力和抗干旱胁迫中的应用，阐述了通过敲除肌醇半乳糖苷合成酶基因 osgols2来提高抗旱性；

15、现有技术5：cn116064570a公开了 tor基因在提高作物抗旱性和氮利用效率中的应用，阐述了雷帕霉素靶激酶基因 tor的抗旱用途；

16、现有技术6：cn115927445a公开了 ospil15基因在调控水稻节水抗旱中的应用，阐述了光敏色素互作因子基因 ospil15在敲除和过表达情况下应对干旱的情况；

17、现有技术7：cn114752573a公开了水稻osga20ox2蛋白及其编码基因在提高植物抗非生物胁迫中的用途，阐述了osga20ox2（gibberellin 20 oxidase 2）的抗旱用途；

18、现有技术8：cn114736890b公开了水稻几丁质酶及其编码基因在增强植物抗非生物胁迫中的用途，阐述了几丁质酶osgh18的抗旱用途；

19、现有技术9：cn114703199a公开了一种植物抗旱性相关的基因 tacml46及应用，阐述了钙调素基因 tacml46的抗旱用途；

20、现有技术10：cn114438103a公开了调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子 osnac15基因及应用，阐述了nac转录因子基因 osnac15的抗旱用途；

21、现有技术11：cn114456248a公开了协同调控水稻对干旱及稻瘟病抗性的脱落酸受体 ospyl2基因及其应用，阐述了脱落酸受体ospyl2的抗旱用途；

22、现有技术12：cn114085854a公开了一种水稻抗旱、耐盐基因 osskl2及其应用，阐述了莽草酸激酶基因 osskl2的抗旱用途；

23、现有技术13：cn113913441a公开了一种水稻新生多肽结合复合体α亚基 naca基因在植物抗渗透胁迫中的应用，阐述了新生多肽结合复合体蛋白naca的抗旱用途；

24、现有技术14：cn114015666a公开了 osparp3基因在调控植物耐旱性中的应用，阐述了多聚adp-核糖聚合酶基因 osparp3的抗旱用途；

25、现有技术15：cn113637682a公开了osmyb26或其突变体在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用，阐述了myb转录因子osmyb26的抗旱用途；

26、现有技术16：cn113337521a公开了 osnac78基因在提高水稻耐旱性中的应用，阐述了nac转录因子osnac78的抗旱用途；

27、现有技术17：cn113046368a公开了水稻基因 ospm1基因及启动子提高水稻耐高温胁迫能力的应用，阐述了水稻膜蛋白基因 ospm1抗旱用途；

28、现有技术18：cn112608938a公开了 osao2基因在控制水稻抗旱性中的应用，阐述了敲除 osao2基因后的抗旱用途；

29、现有技术19：cn114644690a公开了一个水稻基因 kt572在提高植物耐逆性上的应用，阐述了wrky转录因子kt572的抗旱用途；

30、此外，cn114525302a（ oscrkd1基因）、cn112210567a（ osppck2基因）、cn114507672a（ osslt1基因）、cn112143744a（ ospldδ3基因）、cn114381467a（ oscrks2基因）、cn112322627a（ oszfp1基因）、cn112322598a（依赖型谷氨酸脱氢酶基因acgdh）、cn111909937b（ osugt55基因）、cn111961668a（ ossalt基因）、cn111394365a（ osduf6基因）、cn111423500a（ simyb56蛋白基因）、cn111334515a（ ossapk7基因）、cn110577938a（脱落酸（abscisic acid,aba）8’-羟化酶基因 osaba8ox2）、cn110643618a（小桐子myb类转录因子 jcmyb16基因）、cn110592137a（拟南芥 at5g10290基因）、cn110656113a（ap2/erf转录因子 oserf65基因）、cn110760522a（抗旱qtl区段的 ak209基因）、cn110408605a（ga20氧化酶osga2ox8蛋白）、cn109400689a（水稻转录因子 oshrs1突变体）、cn109456982a（myb蛋白 osmyb6基因）、cn111285927b（耐逆性相关蛋白siwrky78）、cn109112142a（水稻耐旱应答基因 osnmcp1）、cn109055390a（ap2/erebp转录因子oserf101）、cn108314716a（拟南芥 atxiw1基因）、cn108341858a（硝酸盐运输蛋白基因 osnar2.1）、cn108359674a（水稻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因 ossapk8）、cn107828805a（环氧类胡萝卜素双加氧酶 osnced3基因）、cn107881179a（吲哚乙酸氨基化合成酶基因 osgh3.6）、cn108004255a（细胞分裂素氧化/脱氢酶基因 osckx4）、cn107827963a（拟南芥 idd14基因）、cn107557370a（ rel1突变体）、cn107326033a（hd-zip ⅳ家族转录因子 osroc4基因）、cn107354163a（ring finge家族e3泛素连接酶 osdhs基因）、cn109112147a（丝裂原活化蛋白激酶激酶 osmpkk10-2基因）、cn107033230a（碱性亮氨酸拉链转录因子 osbzip86基因）、cn106754957a（载体蛋白 osscamp13基因）、cn105543237a（wrky转录因子 kt572基因）、cn105255941a（doubleb-box锌指蛋白 osbbx14基因）、cn105018522a（编码bhlh结构域的基因ak287958）、cn106318952a（膜蛋白基因 osapm1）等；

31、可见，现有技术中，针对水稻干旱胁迫的应对方法大多通过过表达或特征基因的敲除来实现；过表达或敲除目标基因的种类有很多，并未有关于蔗糖转运蛋白（suts）应对干旱胁迫的报导。

32、关于suts的相关现有技术如下：

33、现有技术20：cn103194458a公开了利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，提出了通过超量表达 tasut2基因，使转基因小麦出现提高磷吸收效率和增强低磷响应的表型。

34、现有技术21：cn102775480a公开了一种来源于植物的蔗糖转运蛋白 sbsut5基因与应用，调控甜高粱碳水化合物代谢，最终提高甜高粱乙醇生产指数与经济效益。

35、现有技术22：cn115043919a公开了棉花蔗糖转运蛋白基因 ghsut6在提高植物耐盐性中的应用；过表达 ghsut6拟南芥的耐盐性增强并且过表达 ghsut6的拟南芥可促进蔗糖的吸收，增加蔗糖的积累，对nacl胁迫的耐受性更强，提高了植株的耐盐性。

36、现有技术23：cn103880935a公开了蔗糖转运蛋白atsut2在培育高产转基因植物中的应用，将拟南芥蔗糖转运蛋白2（atsut2）通过基因手段导入野生型植物中得到转基因植物，转基因植物的水稻籽粒大小、生物量和单株产量均高于野生型植物，从而证明该蛋白可以提高植物水稻籽粒大小、生物量和单株产量。

37、现有技术24：cn101851629b公开了转化水稻蔗糖转运蛋白基因 ossut5z提高作物产量的方法和用途，将ossut5z蛋白的编码基因导入目的植物得到转基因植物，为其它作物以及生产实践提供可资利用的数据，在理论与实践上均具有重大意义。

38、现有技术25：cn102250227a公开了植物蔗糖转运蛋白及其编码基因和应用，其说明书记载：

39、蔗糖转运蛋白(sucrose transporter，缩写为sut或suc)是一类12次跨膜膜结合蛋白，广泛存在于高等植物的各种组织和器官中，负责蔗糖的跨膜运输，在蔗糖由源到库转运等各个环节中发挥重要作用。了解植物蔗糖转运蛋白调控的作用机理，揭示蔗糖转运蛋白与逆境胁迫的关系将有助于揭示蔗糖转运机制对植物生长发育及抵抗逆境的调节功能，为提高作物产量与改良品质的基因工程研究提供遗传学依据。

40、该发明提供的蛋白及其编码基因，可以调控植物生长和发育，受多种胁迫诱导，参与羊草对多种胁迫的响应。将基因导入植物，可以提高植物的抗逆性。特别是刈割(cut)可诱导该蛋白的表达，提高糖在植物体内的运输效率，通过转基因手段提高作物蔗糖转运蛋白表达量，可提高草类的刈割后的超补偿生长和耐牧性，有助于实现草原生态系统的健康持续发展。蛋白及其编码基因对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要实用价值。有助于了解植物生长发育过程中潜在的内外部因素对蔗糖转运蛋白调控的作用机理，为揭示蔗糖转运机制对植物生长发育和抗逆性的调节功能、为提高作物产量与改良品质的基因工程研究提供遗传学依据。

41、通过现有技术20～现有技术25的分析可见，针对 sut这一大类基因来说，在盐胁迫（现有技术22）和刈割胁迫（现有技术25）中表现出一定的作用，针对以上两个文件，做进一步分析，如下：

42、在现有技术22中，其应对盐胁迫的方式是通过过表达 ghsut6促进蔗糖转运能力，以提高根部的蔗糖积累，提高细胞膜渗透压，增强植物应答盐胁迫的能力；其具体实现机理可见现有技术22的说明书的163至171段记载：

43、1.过表达 ghsut6d后激活tca（三羧酸）循环通路，该循环通路直接影响植物体内糖的代谢及运输；

44、2.过表达 ghsut6d后激活苯丙烷信号通路，苯丙烷信号通路与细胞氧化还原稳态、细胞内稳态以及细胞自我平衡过程三个相关基因的上调以及翻译过程、肽生物合成、肽代谢、细胞酰胺代谢、细胞氮生物合成以及酰胺生物合成过程这6个基因的下调表达密切相关；

45、3.过表达棉花诱导耐盐基因的表达，降低na+/k+比值；具体来说表现为与na+和k+转运相关基因表达量的上调，其中包括 ghnhx2、 ghchx15、 ghchx20、 ghcipk11、 ghncl、 ghcml27等；

46、所以可见，在现有技术22中，其应对盐碱胁迫的因素主要为：蔗糖转运、苯丙烷信号通路、耐盐基因的表达。

47、在现有技术25中， lcsut1转录水平明显受胁迫诱导，在诱导条件下， lcsut1基因的相对表达量迅速增加，特别是aba和刈割(cut)处理表达量增加量明显； lcsut1能够编码有功能的lcsut1蛋白，可互补蔗糖转运蛋白功能缺失的酵母突变体株系，使其正常生长。可以明确得知，其应对刈割胁迫时，通过促进蔗糖转运即可应对胁迫。

48、此外，通过现有技术22和现有技术25分析可见，其应对胁迫的方式都是通过过表达的方式进行。

49、最后，通过上述文献可以看出关于 sut基因家族在不同物种中有多个成员，作为本领域公知的，在应对环境胁迫时， sut基因家族绝大部分基因并不会起到任何作用，更没有任何文献报道 sut基因家族应对干旱胁迫有过任何研究。

50、以水稻 sut基因家族为例，其具有ossut1-ossut5这5个成员，每个成员可通过可变剪切，在mrna水平上获得多个不同的转录本；在实际实验过程中，我们发现数量庞大的转录本并不是每个都能起到功能，尤其是良好的应对干旱胁迫的明显作用。

51、需要进一步说明的是：在本技术人的在先申请（cn114703221a）中，已经证明，应对干旱胁迫，仅仅依靠蔗糖的由源到库的转运并非是唯一因素，作为本领域公知的，在测试植株的干旱胁迫应对时，必须充分考虑多个因素（如在先申请cn114703221a所示的5大类因素、如cn115851660a所示的6大类因素、如cn116218897a所示的 cata基因、 catb基因、 catc基因、 apx基因、 sod1和 sod2基因表达这6大因素）；

52、本案解决的技术问题是：如何改善水稻应对干旱胁迫的能力。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种表达载体，该表达载体转化到农杆菌中并侵染水稻后，可以显著提高水稻在干旱胁迫下的抗旱能力。

2、同时，本发明还公开了一种 ossut1基因的应用和转基因水稻。

3、为实现上述第一目的，本发明提供如下技术方案：

4、一种表达载体，包括载体、连接在载体上的功能基因、连接在载体上的启动基因，所述功能基因为具有核苷酸序列如seq id no.1所示的 ossut1基因；所述启动基因用于在干旱胁迫下诱导 ossut1基因表达。

5、在上述的表达载体中，所述启动基因为 oshak1基因、 snac1基因、 osmyb2基因等受干旱胁迫诱导表达显著上调的基因。

6、在上述的表达载体中，所述载体为ptck303载体、pcambia1300载体之一。

7、同时，本发明还公开了通过诱导表达 ossut1基因以提高水稻应对干旱胁迫的能力的方法。

8、进一步地，通过诱导表达 ossut1基因以提高水稻应对干旱胁迫时蔗糖从源到库的转运能力。

9、进一步地，通过诱导表达 ossut1基因以提高水稻应对干旱胁迫时，降低水稻的地上部和根系生长被抑制的能力。

10、进一步地，通过诱导表达 ossut1基因以提高水稻应对干旱胁迫时，提高水稻保水能力和/或降低h2o2和mda积累的能力。

11、进一步地，通过诱导表达 ossut1基因以提高水稻应对干旱胁迫时，降低衰老指示基因 sgr表达的能力、降低胁迫响应基因 osnac2表达的能力、提高胁迫响应基因 osbzip23和抗氧化基因 oscatb表达的能力中的一种或多种。

12、最后，本发明还公开了一种转基因水稻，所述转基因水稻过表达核苷酸序列如seqid no.1所示的 ossut1基因；

13、更进一步来说，所述转基因水稻通过将如上任一所述的表达载体转化到菌体中，并侵染水稻得到。

14、在上述的转基因水稻中，所述菌体为农杆菌eha105、eha101中的任何一种。

15、与现有技术相比，本发明的突出特点在于：

16、1. ossut1基因在进行转录时，由于内含子剪切机制、rna编辑的不同，会得到不同的转录本，本发明通过反复研究后，方能确定唯一有效的转录本，付出了创造性的劳动。

17、2.对于本领域技术人员来说，干旱胁迫的应对并非以蔗糖从源到库这一因素决定；本发明惊奇的发现， ossut1基因在水稻保水能力、降低h2o2和mda积累的能力、降低衰老指示基因 sgr表达的能力、降低胁迫响应基因 osnac2表达的能力、提高胁迫响应基因 osbzip23和抗氧化基因 oscatb表达的能力方面相比wt样本具有显著的优势；这是令人难于预期的结果。

18、上述能力的改善是实现转基因水稻干旱胁迫时抗旱能力提高的关键因素。

19、3.本发明的另外一个意义在于，相比于 phak1:fln2转基因植株（该植株涉及蔗糖的生产、转运、消耗等多个方面），本发明的基于蔗糖从源到库的基本功能的优化，结合其他非蔗糖方面的功能的改善，可进一步方便研究在排除蔗糖生产、消耗等方面因素后，实现提高水稻抗旱性的策略（措施）的进一步优化。

20、本发明利用干旱诱导型基因 oshak1的启动子驱动 ossut1的表达，改善胁迫下糖分的长距离转运和其他功能的同步优化，可达到与 phak1:fln2相似的水稻抗旱性提升效果。

21、附图说明

22、图1为本发明中干旱胁迫对野生型水稻地上部 ossut1表达的影响图；

23、图2a为t1代水稻苗期地上部 ossut1的qrt-pcr分析图；

24、图2b为t1代水稻的蔗糖外运速率图，图2b中各柱代表的对象参考图2a的柱的标注；

25、图3a为幼苗期植株在正常情况下的生长情况；

26、图3b为幼苗期植株在20% peg处理下的生长情况；

27、图3c为幼苗期植株的地上部生长状态图；

28、图3d为幼苗期植株的根系生长状态图，图3d中各柱代表的对象参考图3c的柱的标注；

29、图4a为水稻的净光合速率图；

30、图4b为水稻的sps活性图，图4b中各柱代表的对象参考图4a的柱的标注；

31、图5a为水稻的叶片中的蔗糖含量图；

32、图5b为水稻的根中的蔗糖含量图，图5b中各柱代表的对象参考图5a的柱的标注；

33、图5c为水稻的叶片的ser图，图5c中各柱代表的对象参考图5a的柱的标注；

34、图6a为水稻的总根长图；

35、图6b为水稻的根表面积图，图6b中各柱代表的对象参考图6a的柱的标注；

36、图7a为水稻的相对含水量图；

37、图7b为水稻的叶片失水率图；

38、图7c为水稻的h2o2含量图，图7c中各柱代表的对象参考图7a的柱的标注；

39、图7d为水稻的mda含量图，图7d中各柱代表的对象参考图7a的柱的标注；

40、图8a为水稻的 sgr基因表达量图；

41、图8b为水稻的 osnac2基因表达量图，图8b中各柱代表的对象参考图8a的柱的标注；

42、图8c为水稻的 osbzip23基因表达量图，图8c中各柱代表的对象参考图8a的柱的标注；

43、图8d为水稻的 oscatb基因表达量图，图8d中各柱代表的对象参考图8a的柱的标注；

44、图9a为正常培养下，wt、实施例（ phak1:sut1-cds1，缩写为 hak1-cds1）、 phak1: sut1-cds2（缩写为 hak1-cds2）、 hak1-cds3、 hak1-cds4的表型图；

45、图9b为模拟干旱胁迫的条件下，wt、实施例、 hak1-cds2、 hak1-cds3、 hak1-cds4的表型图。