lncRNAm6A甲基化基序作为反复种植失败的诊断标志物及其应用

本发明属于生物医学，具体涉及lncrna m6a甲基化基序作为反复种植失败的诊断标志物及其应用。

背景技术：

1、反复种植失败(recurrent implantation failure，rif)通常被定义为在至少3个新鲜或冷冻周期内将至少4个高质量胚胎移植给40岁以下女性后，无法实现临床妊娠。根据定义，rif患者移植的是优质胚胎，子宫内膜容受性低是其移植失败的主要原因。在正常月经周期，排卵后6-8天为着床窗(window ofimplantation，woi)，此时子宫内膜容受性最高。“胞饮突”是扫描电镜下观察到的一种膜性突起，被认为是子宫内膜容受性的形态学标志。此外，在rif患者中检测到一些被认为与子宫内膜容受性相关的分子变化，如粘蛋白1、整合素β3、同源盒a10(homeboxa10,hoxa10)和白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor，lif)等。然而，rif的确切病因和发病机制尚未完全揭示。

2、长链非编码rna(long coding rna，lncrna)是一类长度超过200个核苷酸的非编码rna。由于其低表达和非蛋白编码的特点，长期以来被认为是转录噪声。近年来，诸多研究证实lncrna在胚胎着床过程中发挥着重要作用。但是，没有研究者具体的研究lncrna介导的调控与rif之间的关系。

3、n6-甲基腺苷(n6-methyladenosine，m6a)于1974年首次被发现，是真核生物中最常见的rna修饰，m6a修饰主要识别5'-rrach-3'(r＝a或g；h＝a、u或c)序列，并在rna终止密码子附近和3'-非翻译区高度富集。m6a的形成、去除等功能是由三种类型的调控蛋白完成的，m6a的形成是由甲基转移酶“writer”复合物催化的，该复合物含有甲基转移酶样3(methyltransferase-like 3，mettl3)、甲基转移酶样14(methyltransferase-like 14，mettl14)、wilms’s tumor 1-associating protein(wtpa)等蛋白。去甲基化酶复合物包括alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenasealkb homolog 5(alkbh5)和脂肪质量和肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene，fto)，它们可以去除m6a，起到“擦除器”的作用。经m6a修饰后的rna可被m6a阅读蛋白识别。yth结构域家族蛋白(yth domainfamily,ythdf)，包括ythdf1、ythdf2、ythdf3等作为m6a阅读蛋白，可进一步调控rna的可变剪接、出核、定位、翻译和稳定性。

4、lncrna的n6-甲基腺苷修饰谱已在许多疾病中建立，如聂娜等研究了结肠腺癌m6a预后相关lncrna特征(参见文献聂娜,黄笑,沈燕.结肠腺癌m6a预后相关lncrna特征分析[c]//中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会.2021年中国肿瘤标志物学术大会暨第十五届肿瘤标志物青年科学家论坛论文集.[出版者不详],2021:2.)，倪书勤等研究了n6-甲基腺苷诱导lncrna抑制乳腺癌干细胞(参见文献倪书勤,何元.n6-甲基腺苷诱导lncrnapvt1靶向作用myc对氯胺酮治疗的乳腺癌细胞干性的影响[j].中华内分泌外科杂志,2022,16(02):174-179.)。但是，目前并没有任何文献公开n6-甲基腺苷修饰的lncrna与反复种植失败有关。

5、针对上述技术问题，发明人在研究过程中意外的发现，lncrna的m6a修饰与rif密切相关，本发明利用m6a修饰的rna免疫沉淀序列(m6amodified rna immunoprecipitationsequence，m6a-seq)首次建立了rif中lncrnam6a甲基化转录谱，并鉴定了差异甲基化峰。然后利用生物信息学构建竞争内源性rna(competing endogenous rna，cerna)网络，揭示lncrnas、mirnas和mrna之间的调控关系。本发明综合分析了rif中lncrnas的m6a修饰，为未来rif的诊断及治疗提供理论基础，具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供了一种反复种植失败的诊断标志物，所述的诊断标志物为m6a lncrna甲基化基序，序列为以下的一种或多种组合：ggacu、ccugga、ccagga、gaagaag、gaaaaag、aggagga、acgagga、augagga、uggagcug、aggagcug、guaucc、guuucc、gucucc、uuuau、uuugu、caucu、cagcu、cagca、cauca。

2、本发明的第二目的是提供所述的诊断标志物在制备非治疗目的的诊断和/或评估反复种植失败的诊断试剂中的应用。

3、本发明的第三目的是提供所述的诊断标志物在制备非治疗目的的诊断和/或评估反复种植失败的试剂盒中的应用。

4、本发明的第四目的是提供所述的诊断标志物在制备非治疗目的的诊断和/或评估反复种植失败的芯片/诊断平台中的应用。

5、本发明的第五目的是提供一种反复种植失败的诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒中包括m6a lncrna甲基化基序，所述的m6a lncrna甲基化基序序列为以下的一种或多种组合：ggacu、ccugga、ccagga、gaagaag、gaaaaag、aggagga、acgagga、augagga、uggagcug、aggagcug、guaucc、guuucc、gucucc、uuuau、uuugu、caucu、cagcu、cagca、cauca。

6、优选的，所述的诊断试剂盒中含有rna提取试剂，m6alncrna甲基化片段富集试剂，以及m6alncrna甲基化测序和分析试剂中的一种或多种组合。

7、优选的，所述的m6alncrna来源于人子宫内膜组织。

8、优选的，所述反复种植失败诊断试剂盒通过分析组织中m6a lncrna甲基化基序图谱，从而诊断反复种植失败情况：当m6a lncrna甲基化基序甲基化图谱显示组织中含有所示基序的一种或多种组合时，判断患者为反复植入失败。

9、优选的，所述的反复种植失败通过以下步骤诊断：

10、(1)提取待测组织总rna；

11、(2)rna甲基化免疫共沉淀法富集m6a lncrna甲基化片段，洗脱，纯化，得到待测样品；

12、(3)取待测样品进行m6a lncrna甲基化测序，获得m6a lncrna甲基化图谱，根据图谱所显示的m6alncrna甲基化基序类型，诊断是否反复种植失败。

13、本发明的第六目的是提供m6a lncrna甲基化基序作为治疗靶点在制备用于治疗反复种植失败药物中的应用，所述的m6a lncrna甲基化基序为如下序列的一种或多种组合：ggacu、ccugga、ccagga、gaagaag、gaaaaag、aggagga、acgagga、augagga、uggagcug、aggagcug、guaucc、guuucc、gucucc、uuuau、uuugu、caucu、cagcu、cagca、cauca。

14、本发明的有益效果是：

15、(1)本发明通过对反复种植失败患者进行m6a修饰的lncrna进行全基因组测序，得到的数据存入geo数据库(geo登录号:gse205398)；

16、(2)本发明通过m6a lncrna甲基化测序，以及对m6a lncrna甲基化位点进行可视化分析，发现本发明展示的反复种植失败患者组织中和对照组的m6a lncrna甲基化基序既有保守序列，又有特有序列，所述的m6a lncrna甲基化基序特有序列如下：ggacu、ccugga、ccagga、gaagaag、gaaaaag、aggagga、acgagga、augagga、uggagcug、aggagcug、guaucc、guuucc、gucucc、uuuau、uuugu、caucu、cagcu、cagca、cauca；

17、(3)本发明得到的m6a lncrna甲基化基序，可以作为反复种植失败的诊断标志物，经过验证，具有良好的诊断价值；

18、(4)本发明得到的m6alncrna甲基化基序，可以作为反复种植失败潜在的治疗靶点；

19、(5)将本发明所述的m6a lncrna甲基化基序制备成反复种植失败的诊断试剂、试剂盒、芯片或诊断平台，从而在反复种植失败的诊断/评估中发挥重要作用，具有良好的应用价值。