一种鉴定大白菜杂交种纯度的方法及其使用的SNP引物组合

本发明属于生物，具体涉及一种鉴定大白菜杂交种纯度的方法及其使用的snp引物组合；杂交种指杂交一代种，可能有亲本混杂。

背景技术：

1、大白菜属于十字花科芸薹属叶用蔬菜，是典型的孢子体型自交不亲和类型，其作为人们日常生活中一类重要蔬菜，具有极高的经济与营养价值。大白菜为异花授粉作物，由于其自交不亲和性受到温度等环境因素影响，时常会出现亲本有极少量自交结实现象。目前大白菜杂交种主要采用自交不亲和性制种，杂种率达不到100％。由于现代分子技术的发展及人们对大白菜不同需求的变化，使得大白菜优新品种数量急剧增加，与此同时品种侵权、品种套盘的现象也层出不穷，屡禁不止。为维护育种者合法权益，减少农民及生产者的经济损失，在杂交种进入市场之前，均需进行纯度鉴定。种子纯度是种子质量的重要指标之一，纯度降低会导致减产甚至有可能抵消一个新品种的增产潜力。因此选择一种既高效又稳定的纯度鉴定方式，对大白菜新品种的纯度快速鉴定是十分必要的。

2、随着测序技术的进步，分子标记技术在遗传与育种研究中的应用越来越普及，已经成为检测作物杂交种纯度真实且可靠的方法之一。分子标记技术不仅克服了田间种植鉴定易受环境影响、对鉴定专家水平要求高、周期长、占地面积大的缺点，还具有数量多，多态性高，不受季节、环境限制，不存在表达与否的优点，在品种纯度鉴定方面有着广泛的应用前景。

3、近几年，已有一大批ssr标记定位到大白菜连锁图谱上。但利用ssr标记不能适应自动化、高通量、大规模的要求，同时ssr检测方式极易导致不真实、假阳性、假阴性的结果。随着白菜基因组测序的开展，大规模开发大白菜snp标记成为可能。与ssr相比，snp标记具有稳定性好、密度高、分布广泛、适于规模化筛选等优点，现已被应用于辣椒、黄瓜等作物的品种鉴定以及种子纯度检测等方面。kasp作为目前主要的snp分型检测技术之一，相较于传统的分子标记(rflp，sts、ssr等)有其独特的优势。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种鉴定大白菜杂交种纯度的方法及其使用的snp引物组合。本发明方法和引物组合可以用于鉴定大白菜杂交种纯度。

2、本发明的目的之二在于提供上述snp引物组合的用途。

3、本发明的目的之三在于提供一种snp位点组合。

4、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

5、本发明第一方面提供一种snp位点组合，包括大白菜基因组的8个snp位点；所述8个snp位点具体如下：bcsnp01位点为3号染色体上的第3106517位核苷酸；bcsnp02位点为6号染色体上的第20202980位核苷酸；bcsnp03位点为9号染色体上的第3549613位核苷酸；bcsnp04位点为10号染色体上的第20135946位核苷酸；bcsnp05位点为1号染色体上的第26369261位核苷酸；bcsnp06位点为2号染色体上的第11733689位核苷酸；bcsnp07位点为5号染色体上的第17590267位核苷酸；bcsnp08位点为7号染色体上的第22173529位核苷酸。snp位点bcsnp01至bcsnp08在染色体上的位置是基于大白菜chiifu-401-42参考基因组序列比对确定的，所述大白菜chiifu-401-42参考基因组序列的版本号为v3.0。

6、本发明第二方面提供一种snp引物组合，包括第一引物组至第八引物组，其中，

7、第一引物组用于扩增snp位点bcsnp01以确定snp位点的bcsnp01对应的基因型，所述snp位点bcsnp01位于3号染色体上的第3106517位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为a或g；

8、第二引物组用于扩增snp位点bcsnp02以确定snp位点的bcsnp02对应的基因型，所述snp位点bcsnp02位于6号染色体上的第20202980位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为g或c；

9、第三引物组用于扩增snp位点bcsnp03以确定snp位点的bcsnp03对应的基因型，所述snp位点bcsnp03位于9号染色体上的第3549613位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为t或g；

10、第四引物组用于扩增snp位点bcsnp04以确定snp位点的bcsnp04对应的基因型，所述snp位点bcsnp04位于10号染色体上的第20135946位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为g或c；

11、第五引物组用于扩增snp位点bcsnp05以确定snp位点的bcsnp05对应的基因型，所述snp位点bcsnp05位于1号染色体上的第26369261位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为c或t；

12、第六引物组用于扩增snp位点bcsnp06以确定snp位点的bcsnp06对应的基因型，所述snp位点bcsnp06位于2号染色体上的第11733689位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为t或a；

13、第七引物组用于扩增snp位点bcsnp07以确定snp位点的bcsnp07对应的基因型，所述snp位点bcsnp07位于5号染色体上的第17590267位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为a或c；

14、第八引物组用于扩增snp位点bcsnp08以确定snp位点的bcsnp08对应的基因型，所述snp位点bcsnp08位于7号染色体上的第22173529位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为t或c；

15、snp位点bcsnp01至bcsnp08在染色体上的位置是基于大白菜chiifu-401-42参考基因组序列比对确定的，所述大白菜chiifu-401-42参考基因组序列的版本号为v3.0。

16、在上述snp引物组合中，作为一种优选实施方式，所述第一引物组由序列表中seqid no：1所示的正向引物1f1、seq id no：2所示的正向引物1f2和seq id no：3所示的反向引物1r组成；

17、所述第二引物组由序列表中seq id no：4所示的正向引物2f1、seq id no：5所示的正向引物2f2和seq id no：6所示的反向引物2r组成；

18、所述第三引物组由序列表中seq id no：7所示的正向引物3f1、seq id no：8所示的正向引物3f2和seq id no：9所示的反向引物3r组成；

19、所述第四引物组由序列表中seq id no：10所示的正向引物4f1、seq id no：11所示的正向引物4f2和seq id no：12所示的反向引物4r组成；

20、所述第五引物组由序列表中seq id no：13所示的正向引物5f1、seq id no：14所示的正向引物5f2和seq id no：15所示的反向引物5r组成；

21、所述第六引物组由序列表中seq id no：16所示的正向引物6f1、seq id no：17所示的正向引物6f2和seq id no：18所示的反向引物6r组成；

22、所述第七引物组由序列表中seq id no：19所示的正向引物7f1、seq id no：20所示的正向引物7f2和seq id no：21所示的反向引物7r组成；

23、所述第八引物组由序列表中seq id no：22所示的正向引物8f1、seq id no：23所示的正向引物8f2和seq id no：24所示的反向引物8r组成。

24、在序列(seq id no：)1、4、7、10、13、16、19、22中，自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即fam荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。在序列(seq idno：)2、5、8、11、14、17、20、23中，自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列(即hex荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。

25、在上述snp引物组合中，作为一种优选实施方式，所述第一引物组由序列表中seqid no：1自5’末端起第22至50位所示的正向引物1f1、seq id no：2自5’末端起第22至47位所示的正向引物1f2和seq id no：3所示的反向引物1r组成；

26、所述第二引物组由序列表中seq id no：4自5’末端起第22至50位所示的正向引物2f1、seq id no：5自5’末端起第22至50位所示的正向引物2f2和seq id no：6所示的反向引物2r组成；

27、所述第三引物组由seq id no：7自5’末端起第22至46位所示的正向引物3f1、seqid no：8自5’末端起第22至44位所示的正向引物3f2和seq id no：9所示的反向引物3r组成；

28、所述第四引物组由seq id no：10自5’末端起第22至43位所示的正向引物4f1、seqid no：11自5’末端起第22至43位所示的正向引物4f2和seq id no：12所示的反向引物4r组成；

29、所述第五引物组由seq id no：13自5’末端起第22至44位所示的正向引物5f1、seqid no：14自5’末端起第22至47位所示的正向引物5f2和seq id no：15所示的反向引物5r组成；

30、所述第六引物组由seq id no：16自5’末端起第22至46位所示的正向引物6f1、seqid no：17自5’末端起第22至46位所示的正向引物6f2和seq id no：18所示的反向引物6r组成；

31、所述第七引物组由seq id no：19自5’末端起第22至52位所示的正向引物7f1、seqid no：20自5’末端起第22至51位所示的正向引物7f2和seq id no：21所示的反向引物7r组成；

32、所述第八引物组由seq id no：22自5’末端起第22至47位所示的正向引物8f1、seqid no：23自5’末端起第22至46位所示的正向引物8f2和seq id no：24所示的反向引物8r组成。

33、由于在序列(seq id no：)1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23中，自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列，从第22位起才为引物的特异性片段，上述优选的各个引物组中的两个正向引物均为序列(seq id no：)1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23中的特异性序列。

34、在鉴定待测大白菜杂交种纯度时，如果采用测序方法确定snp位点的基因型，则可以直接使用上述优选的八个引物组，且各个引物组中正向引物由特异性片段组成，不含有荧光标签序列，当然也可以采用含有荧光标签的序列；如果采用荧光信号来确定snp位点的基因型，则可以在上述优选的八个引物组的各个引物组的两个正向引物的5’端分别添加发出不同颜色荧光标签序列，荧光标签序列可以选自fam、tet、vic、hex中的一种。

35、采用上述各个引物组进行pcr时，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。

36、本发明第三方面提供一种含有上述任一所述snp引物组合的试剂盒，其也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的用途为鉴定大白菜杂交种纯度。

37、所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。

38、所述试剂盒中还可以包括其他竞争性等位基因特异性pcr的试剂。

39、本发明第四方面提供上述任一所述snp位点组合或上述任一所述snp引物组合的应用，可为x1)或x2)：x1)制备用于鉴定大白菜杂交种纯度的试剂盒；x2)鉴定大白菜杂交种纯度。

40、本发明第五方面提供鉴定待测大白菜杂交种纯度的方法。

41、本发明所保护的鉴定待测大白菜杂交种纯度的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：

42、(a1)获得n株待测大白菜杂交种的基因组dna；n为大于95的自然数；

43、(a2)从步骤(a1)中选取8-12株(如8-10株、10-12株、8株、10株或12株)待测大白菜杂交种的基因组dna，针对选取的每株待测大白菜杂交种的基因组，以该株待测大白菜杂交种的基因组为模板，分别采用所述snp引物组合中8个引物组(各个正向引物均含有荧光标签序列)进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；

44、(a3)完成步骤(a2)后，采用仪器检测各个pcr扩增产物的荧光信号，统计8个引物组显示代表杂合型的荧光信号比如绿色荧光信号的株数；显示代表杂合型的荧光信号株数最多的引物组即为目的引物组；

45、(a4)分别以步骤(a1)获得的n株待测大白菜杂交种的基因组dna为模板，分别采用目的引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；

46、(a5)完成步骤(a4)后，采用仪器检测各个pcr扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测大白菜杂交种的纯度。

47、上述方法一中，所述“根据荧光信号的颜色获得待测大白菜杂交种的纯度”的方法可为：统计目的引物组显示代表杂合型的荧光信号的株数、显示代表纯合型的荧光信号的株数和无荧光信号的株数，按照如下公式计算纯度，当目的引物组有两个或更多个时，分别计算每个目的引物组的纯度，之后求平均值作为最终得到的待测大白菜杂交种的纯度；

48、无荧光信号的株数＝n-显示代表杂合型的荧光信号比如绿色荧光的株数-显示代表纯合型的荧光信号比如红色荧光和蓝色荧光的株数；

49、纯度＝目的引物组显示代表杂合型的荧光信号比如绿色荧光的株数/(n-目的引物组无荧光的株数)×100％。

50、上述方法一中，所述进行pcr扩增的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，6个循环)，直至结果满意为止。

51、本发明所保护的鉴定待测大白菜杂交种纯度的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：

52、(b1)获得n株待测大白菜杂交种的基因组dna；n为大于95的自然数；

53、(b2)从步骤(b1)中选取8-12株(如8-10株、10-12株、8株、10株或12株)待测大白菜杂交种的基因组dna，针对选取的每株待测大白菜杂交种的基因组，以该株待测大白菜杂交种的基因组为模板，分别采用上述snp引物组合中8个引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；

54、(b3)取步骤(b2)得到的各个pcr扩增产物，测序；根据测序结果，获得基于8个snp位点的基因型为杂合型的株数，株数最多的引物组即为目的引物组；

55、(b4)分别以步骤(b1)获得的n株待测大白菜杂交种的基因组dna为模板，分别采用目的引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；

56、(b5)取步骤(b4)得到的各个pcr扩增产物，测序；根据测序结果获得待测大白菜杂交种的纯度。

57、上述方法二中，snp引物组合中8个引物组的引物可以含有荧光标签序列，也可以不含有荧光标签序列。

58、上述方法二中，所述“根据测序结果获得待测大白菜杂交种的纯度”的方法可为：统计目的引物组基于snp位点的基因型为杂合型的株数和没有获得pcr扩增产物的株数，按照如下公式计算纯度，当目的引物组有两个或更多个时，分别计算每个目的引物组的纯度，之后求平均值作为最终得到的待测大白菜杂交种的纯度；

59、纯度＝目的引物组基于snp位点的基因型为杂合型的株数/(n-目的引物组没有获得pcr扩增产物的株数)×100％。

60、上述任一所述的方法中，所述待测大白菜杂交种可为鲁春白一号、利春一号、吉红娃娃、胶研夏星、北京小杂67、夏冠、丰抗58、中白50号、陕5201、西由铁根、鲁白二号、北京大牛心、津白56、京秋新56号、绿健85、锦秋1号、京夏1号、北京新三号、辽白十号、秋绿60、北京106、中白81号、精选珍绿60、sgk1008、玲珑黄、西白10号、豫新9号、沈白gms02、春获、优选早熟5号f1、京秋65号、黄芽14号、吉红65、金娃娃、冠春、华阳白一号、北京桔红心、yhbc1516、青研四号、小义和秋、京秋80、京翠75号、华耐b1102、津绿80东方皇冠、浙冬1号、天正春白二号、京秋1号、夏阳303、津秀1号、津娃娃1号、黔白4号、青研春白3号、青研秋白1号、西春白3号、金冠2号、郑白四号、华耐cc001、郑杂二号、优选小杂56、浙白6号、丰南f115-93、春宝、北京桔红2号、天正品优一号、北京小杂50、莱白一号、京春白2号、天正桔红62、中白61号、豫新1号、万农六号、青研cr21、cr天白15、京春99、菊心一号、德丰1号、秦白二号、胶白7号、山地王2号、金秋68、中白58号、京农988、新早89-8、丰抗70、郑早55、京春娃娃菜、油绿3号、庆农45天、潍白4号、吉红308、春玉黄、秋早60、冬春娃娃菜、义和0906、绿笋70、京翠70、北京改良67、贵龙五号、秋玉78、热抗7号、京研快菜、中白78号、小杂60、津绿60、津研快绿2号、泰京50、津研快菜1号、津绿75、山东五号、津秋78、鲁白16号、莱白38、小杂56、丰抗70号、莱6014、青研春白一号、津研快菜30、早皇白、义和1410、德高cr117、神青翠玉、中包68和神青冬宝中的任一种。

61、上述任一所述的方法中，n的数值越大，鉴定待测大白菜杂交种纯度的准确性越高。

62、需要说明的是，本发明所说的大白菜杂交种指杂交一代种，只可能有亲本混杂；不是机械混杂，即若干种大白菜杂交种混合而成。

63、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

64、本发明提供的snp引物组合可在大白菜杂交种的种子或幼苗期进行早期鉴定，保证杂交种的纯度，切实保护生产者和育种家的权益，并为大白菜品种的种子质量管理提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。