与调控栽培花生侧枝生长习性高度连锁的分子标记及应用

本发明涉及与调控栽培花生侧枝生长习性高度连锁的分子标记及应用，属于分子生物学领域。

背景技术：

1、栽培花生(arachis hypogaea l.；2n＝4x＝40)是重要的油料作物，其世界总产量达4765万吨，仅次于大豆、油菜和向日葵。与其他作物不同，花生是在地上开花、地下结果，侧枝与地面的夹角大小影响果针的入土和荚果的发育，因此侧枝生长习性(又称分枝习性或株型)是花生重要的描述性状和农艺性状。野生四倍体花生a.monticola为匍匐生长，侧枝都贴地或部分贴地生长。而栽培花生具有四种不同且容易区分的生长习性分别为：蔓生(prostrate)、半蔓(spreading)、半直立(bunch)和直立(erect)。直立型花生株型紧凑，荚果主要集中在植株底部，这种类型的花生适合高密度种植。相比之下，匍匐型植株占地面积更大，它的侧枝贴地生长，因此更利于果针入土和荚果发育，每株的荚果数比直立型多。因此，花生的生长习性不仅可以帮助育种家和其他研究人员鉴定特定性状，还影响着机械栽培和病害管理等农业技术的实施。

2、栽培花生可能来源于两个二倍体野生种arachis duranensis(aa)和arachis(bb)之间的杂交事件，其基因组总大小约为2.7gb，重复序列含量约为64％。与许多多倍体物种一样，栽培花生经历了遗传瓶颈，再加上驯化的影响，极大缩小了其遗传多样性，可遗传变异不到13％。前人利用限制性片段长度多态性(rflp)、扩增片段长度多态性(aflp)、裂解扩增多态性序列(capss)和简单序列重复(ssr)标记构建了大量的遗传图谱。由于分子标记的数量少，这些低密度遗传图谱限制了qtl定位的效率和准确性。因此，高密度遗传图谱是qtl定位、标记辅助选择(mas)和图位克隆的基础。随着高通量测序技术的进步和栽培花生基因组的公布，以相对较低的成本就能获得数百万个单核苷酸多态性(snp)或插入/缺失(indel)标记，构建了上图数千个标记的高密度遗传图谱。前人研究把花生侧枝生长习性的qtl定位在第15号染色体一个较小的qtl区间，但是未开发出与株型高度连锁的分子标记。

3、竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)可在广泛的基因组dna样品中(甚至是一些复杂基因组的dna样品)，对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。与taqman双色标记探针法、massarray分子量阵列技术、affymetrix snp芯片相比，kasp技术灵活性更高、试剂成本低，同样成本至少获得两倍的数据量。因此，利用花生重组自交系群体，对花生侧枝生长习性的调控基因进行qtl定位，并基于目标基因开发分子标记，可应用于花生育种中。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一个与调控栽培花生侧枝生长习性高度连锁的分子标记及应用。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、用于检测与调控栽培花生侧枝生长习性相关的突变位点的产品包括：

4、(1)用于检测突变位点的引物组合物，所述栽培花生侧枝生长习性相关的突变位点为：

5、a15.156974332-156976202的indel位点前后100bp的序列为seq id no.1或seqid no.2；

6、a15.156976352的indel位点前后100bp的序列如seq id no.3或seq id no.4；

7、a15.156971952的indel位点前后100bp的序列为seq id no.5或seq id no.6；

8、所述引物组合包括：

9、扩增a15.156974332-156976202的indel位点的kasp引物组合为：

10、qgha15_mu1_f1:5’-tgtgttttgattttggctctgctag-3’(seq id no.7)，

11、qgha15_mu1_f2:5’-caaaacagcaagttgaagaatgttac-3’(seq id no.8)，

12、qgha15_mu1_com:5’-tacaatccttttagtggccttactc-3’(seq id no.9)；

13、扩增a15.156976352bp的indel位点的kasp引物组合为：

14、qgha15_mu2_f1:5’-ggaggctctttgaatactcaagtac-3’(seq id no.10)，

15、qgha15_mu2_f2:5’-gggaggctctttgaatactcaagtat-3’(seq id no.11)，

16、qgha15_mu2_com:5’-taaagtgattaagtaagggcttactctgaa-3’

17、(seq id no.12)；

18、扩增a15.156971952的indel位点的kasp引物组合为：

19、qgha15_mu3_f1:5’-aaaaggtcattaataattcacaacattat-3’(seq id no.13)，

20、qgha15_mu3_f2:5’-catgtaggtccgtgcctgaca-3’(seq id no.14)，

21、qgha15_mu3_com:5’-gctctctataaagctgagcctgaaag-3’(seq id no.15)；

22、(2)包含(1)中所述的引物组合物的试剂或者试剂盒。

23、所述的用于检测与调控栽培花生侧枝生长习性相关的indel位点的产品在以下任意一项中的应用：

24、(1)鉴定花生株型；

25、(2)花生分子标记辅助育种；

26、(3)花生遗传图谱构建。

27、鉴定栽培花生侧枝生长习性的方法，包括以下步骤：

28、(1)提取待鉴定花生样本的dna，根据如上所述的产品检测花生侧枝生长习性相关的突变位点，根据基因型确定花生的侧枝生长习性；

29、其中，a15.156974332-156976202的indel位点的分型结果为突变型del：del时，则待鉴定花生样本侧枝生长习性表现为直立；

30、a15.156976352的indel位点的分型结果为突变型gta:gta时，则待鉴定花生样本侧枝生长习性表现为直立；

31、a15.156971952的indel位点的分型结果为突变型mite:mite时，则待鉴定花生样本侧枝生长习性表现为直立；

32、三个位点的分型结果存在一个以上的突变位点，则待鉴定花生样本侧枝生长习性表现为直立；若三个位点的分型结果都为野生型(wt:wt；g:g；wt:wt)时，则待鉴定花生样本侧枝生长习性表现为匍匐。

33、本发明有益效果：

34、本发明利用豫花15和w1202为亲本的重组自交系群体，构建高密度连锁图谱，定位到一个调控花生侧枝生长习性的qtl区间(qgha15)，qgha15影射的物理图谱位置为chr15:156,982,893bp-157,141,368bp，lod值为41.91-74.23，表型贡献率(pve)为45.5％-65.9％。该qtl区间与来自不同亲本的遗传群体定位的结果有重叠，进一步验证了该qtl区间的稳定性。本发明基于qgha15区间的精细定位和基因转录本序列的差异，获得了调控花生侧枝生长习性的候选基因ahmads-box。基于ahmads-box基因组序列的野生型和突变型序列，开发了a15.156974332-156976202的indel位点、a15.156976352的indel位点和a15.156971952的indel位点的kasp分子标记，该标记在花生自然群体材料中的分型结果与侧枝生长习性连锁，证明了该标记的准确性。

35、本发明的kasp标记能够快速准确的获得花生侧枝生长习性类型，且能应用于花生分子辅助标记育种中。