RPA-CRISPR/Cas12a引物组、gRNA和探针、试剂盒和检测方法

本发明涉及生物领域，具体为一种检测副猪嗜血杆菌的rpa-crispr/cas12a引物组、grna和探针、试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、副猪嗜血杆菌病是现代畜牧养殖中最为常见的细菌性疾病之一，各个年龄段均可感染发病，是由副猪嗜血杆菌引起的一种疾病，临床症状主要以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎，呼吸困难、体温升高等，并可与其他病原混合感染或继发感染。副猪嗜血杆菌属于革兰氏阴性菌，该细菌在含有血清和nad的培养基中生长良好，与金黄色葡萄球菌共培养时可形成明显的卫星菌落。该菌已知有15个血清型，中国主要的血清型是4、5、12型，给养殖业造成严重的经济损失。

2、重组酶聚合酶等温扩增技术（recombinase polymerase amplification, rpa）是一种高度敏感的等温扩增技术，通过重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、引物对靶标进行扩增，可在37℃-42℃范围内进行。因rpa反应条件温和、扩增效率高，设备简单，近几年在细菌、真菌、病毒、寄生虫等快速检测中应用较多，适用于基层及现场检测的需要。

3、crispr‐cas是广泛存在于古生菌和细菌中的获得性免疫系统，对进入的外源核酸进行记录，当同样的外源核酸再次进入时，通过cas蛋白对其剪切降解。研究人员发现cas12a可在顺式系统中以grna为导向切割dsdna靶标外，同时具有反式切割活性，反式切割活性是由grna与互补的靶序列杂交而触发，可对非靶序列的单链dna进行切割。根据这一发现，研究人员将cas12a应用到病原检测中，设计单链dna与淬灭基团和荧光基团相结合的报告分子，当检测样品中有靶序列存在时，grna与靶序列结合形成复合物，激活其核酸酶活性对靶序列进行切割，同时，反式切割活性对报告分子进行任意切割，根据荧光信号有无对结果进行判定。

4、近年来，由于对快速便捷的病原检测方法的需要，doudna针对人乳头瘤病毒的检测，将rpa与crispr 检测进行结合，建立了dna内切酶靶向crispr反式报告系统，自此，crispr 检测方法被应用的越来越多，如sars-cov-2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、寄生虫等多种病原菌的病原检测。

5、cn116463462a公开了一种ibrv病毒的rpa-crispr/cas12a检测方法及其应用，其公开了在30min内检测到最低初始模板浓度20pg/μl的ibrv的dna。

6、由于copies/μl是以质粒检测为对象的表达单位，以病毒、菌为检测对象的的表达单位一般为pg/μl；就现有技术来看，很少有基于rpa-crispr/cas12a的关于菌的检测下限低于1 pg/μl的案例。

7、本案解决的技术问题是：如何基于rpa-crispr/cas12a方法建立针对副猪嗜血杆菌的准确检测。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供检测副猪嗜血杆菌的rpa-crispr/cas12a引物组、grna和探针，其具有检出限低、检测准确性高的优点。

2、同时，本发明还公开了一种试剂盒以及副猪嗜血杆菌的检测方法。

3、为实现上述第一目的，本发明提供如下技术方案：

4、一种检测副猪嗜血杆菌的rpa-crispr/cas12a引物组、grna和探针，包括rpa引物组、grna和探针；

5、所述rpa引物组包括如seq id no.1和seq id no.2所述的上游引物和下游引物；

6、grna的序列如seq id no.3所示；

7、所述探针的序列为5'-fam-ttatt-bhq1-3'；

8、所述探针的5端和3端分别为荧光基团和淬灭基团。

9、如下表1所示：

10、表1

11、 核酸序列(5’-3’) rpa f1 5’-aatctgtaactgtggcagcaggttatactca-3’（seq id no.1） rpa r1 5’-agtaccataagagtagtttccatacacgcca-3’（seq id no.2） grna1 5’-uaauuucuacuaaguguagauuacaacaccaugaccaccaucaa-3’（seq id no.3） 探针 5'-fam-ttatt-bhq1-3'

12、同时，本发明还公开了一种试剂盒，含有如上所述的检测副猪嗜血杆菌的rpa-crispr/cas12a引物组、grna和探针。

13、同时，本发明还公开了一种使用如上所述的引物组、grna和探针检测副猪嗜血杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

14、步骤1：提取待检测样本的dna；

15、步骤2：使用rpa引物组和核酸扩增试剂对步骤1中获得的dna进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

16、步骤3：将grna、探针和cas12a酶与步骤2中得到的核酸扩增产物混合，对所述核酸扩增产物进行crispr/cas12a反应；

17、步骤4：通过荧光检测确定检测结果。

18、在上述的方法中，所述步骤2的体系为：

19、浓度为10 μmol/l的上游引物 2.4 μl；

20、浓度为10 μmol/l的下游引物 2.4 μl；

21、primer free rehydration buffer 29.5μl；

22、去离子水11.2 μl；

23、将上述物质混匀后加入冻干管内，吹打混匀，将其一分为二，每管中加入1μl dna模板，混匀后每管中加入1.25 μl浓度为280 mmol/l的mgo ac。

24、在上述的方法中，所述步骤3的体系为：

25、浓度为1μmol/l的cas12a酶 1.5μl；

26、浓度为1μmol/l的grna 1.5μl；

27、10倍单位的neb buffer 2.1 3μl；

28、浓度为10 μmol/l的ssdna报告分子1.35μl；

29、步骤2的核酸扩增产物3μl。

30、在上述的方法中，步骤2的反应条件为39℃反应20min；

31、步骤3的反应条件为37℃反应30min，在蓝光灯下观察荧光信号。

32、与现有技术相比，本发明的突出特点在于：

33、1）本发明rpa-crispr/cas12a的方法对副猪嗜血杆菌的检测限比普通pcr最低检测限高出104倍，具有良好的灵敏度。

34、2）本发明rpa-crispr/cas12a的方法对副猪嗜血杆菌的检测具有较高的特异性。