一种便捷的磁珠法水体病毒核酸提取试剂盒的配制及其应用的制作方法

本发明涉及病毒感染性疾病，具体为一种便捷的磁珠法水体病毒核酸提取试剂盒的配制及其应用。

背景技术：

1、病毒感染性疾病的传播途径多种多样，但是在许多病毒性疾病发生和流行过程中，水是病毒传播的一种重要途径。特别是污水中由于存在大量的有机物质，因此适合各种微生物的生长。水体中的微生物主要源于土壤、人类和动物的排泄物，其中如肝炎病毒、轮状病毒形状病毒、诺如病毒、新型冠状病毒和猴痘病毒等多种病毒能够在水中存活较长时间，可以通过水体进行传播，给人民的身体健康和国民经济建设等造成严重的威胁，如新型冠状病毒会对人体造成咳嗽、胸痛、发烧等症状，严重的甚至会造成呼吸衰竭危及患者的生命安全，而猴痘病毒会引起患者出现皮疹或粘膜病变并伴随发烧、头痛、肌肉酸痛等症状，严重的会引起其他并发症对患者的健康造成威胁。为此有必要对城市中的各类水系统进行定期检测，从而控制病毒介水传播的潜在途径，保证城市的公共健康。

2、水中病毒的浓集与细菌不同。细菌的浓集可完全依靠机械阻留于膜上，而病毒因其颗粒直径很小，一般多基于吸附、免疫化学、相分离等作用，基本方法可分为两类：1）吸附洗脱法，包括膜吸附法、氧化铁、聚电解质吸附方法、氢氧化铝絮凝吸附法和相分离法等。2）以病毒物理学特征为基础的方法，如超速离心法、反渗透法、电渗析法等。在上述方法中，一般认为如超速离心法、电渗析法等不仅需要一定的设备条件，且检水量有限，耗时较长，作为辅助手段进行水体病毒的再浓缩是有效的，但是在实际应用中存在较大的限制。

3、现有的水体病毒检测技术在富集的过程中常采用铝盐絮凝法和过滤法，前者在络合溶解胶体的过程中会引入edta等干扰物质，影响后续的检测；采用过滤法，所处理的水体体积有限，且在滤膜上会浓集到腐殖酸等干扰物质。

技术实现思路

1、为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种便捷的磁珠法水体病毒核酸提取试剂盒的配制及其应用，具备便捷、高灵敏度地提取各类水体样本中地病毒核酸的优点，解决了水体病毒核酸提取往往需要较长时间的病毒富集操作，且在操作过程中容易引入其他的干扰物质，对后续的检测造成干扰；或者在病毒富集过程中需要用到一定的设备，操作繁琐，因此有必要提供一种病毒核酸提取前处理时间短、操作便捷、灵敏度高的磁珠法水体病毒核酸提取试剂盒。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种便捷的磁珠法水体病毒核酸提取试剂盒的配制，包括裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、蛋白酶k液、磁珠液；

3、所述裂解结合液包括水、离液盐、非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、ph缓冲液、醇类以及离子螯合剂；

4、所述洗涤液1的组分包括离液盐，非离子表面活性剂、ph缓冲液以及醇类；

5、所述洗涤液2的组分包括ph缓冲液以及醇类；

6、所述洗脱液的组分包括离子螯合剂与ph缓冲液；

7、所述蛋白酶k液的组分包括蛋白酶k、甘油、氯化钙、三羟甲基氨基甲烷、纯化水；

8、所述磁珠液的组分包括四氧化三铁、纯化水。

9、作为本发明优选的，所述离液盐包括2~8 m盐酸胍、3~6 m异硫氰酸胍、0.2~0.5 m氯化钠、0.1~2.5 m高碘酸钠、0.5~3 m碘化钠中的一种或多种。

10、作为本发明优选的，所述非离子表面活性剂包括0.1（v/v）%~10（v/v）% triton x-100、0.5（w/v）%~10（w/v）% peg 200、0.5（v/v）%~4（v/v）% np-40、0.05（v/v）%~1（v/v）%tween-20、0.01（v/v）%~1（v/v）% tween-80的一种或多种。

11、作为本发明优选的，所述阴离子表面活性剂包括0.5（w/v）%~5（w/v）% sds、0.1（w/v）%~5（w/v）% sls、0.5（w/v）%~3（w/v）% tls、0.1（w/v）%~3（w/v）% sdbs的一种或多种。

12、作为本发明优选的，所述ph缓冲液包括1~50 mm tris-hcl缓冲液、10~100 mm 醋酸-醋酸钠缓冲液、10~100 mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、1~100 mm pbs缓冲液的一种。

13、作为本发明优选的，所述的醇类包括10（v/v）%~60（v/v）%乙醇、10（v/v）%~50（v/v）%异丙醇、10（v/v）%~65（v/v）%异戊醇的一种或多种。

14、作为本发明优选的，所述的离子螯合剂包括1~50 mm edta、1~10 mm edta•na2、1~100 mm egta的一种或多种。

15、作为本发明优选的，所述纳米磁珠为粒径在30 nm~4000 nm范围内的羟基或羧基磁珠，单分散或多分散。

16、作为本发明优选的，按所述的配制制成的磁珠法水体病毒核酸提取试剂盒在提取水体中新型冠状病毒、猴痘病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人乳头瘤病毒或天花病毒等所有病毒核酸中的应用。

17、本发明还提供了所述便捷的磁珠法水体病毒核酸提取试剂盒的应用，将其用于水体样本中病毒核酸的提取，提取流程包括如下步骤：

18、将水样分装成大于50 ml/瓶，进行4℃，2,500x g离心30分钟，每瓶转移离心后的上清液至干净的试剂瓶中作为待测样本，提取上样体积为1~15ml。

19、在提取板第1孔中加入裂解结合液、蛋白酶k液、磁珠液、待测样本，在第2孔中加入裂解液、蛋白酶k液、待测样本，在第3孔中加入裂解液、蛋白酶k液、待测样本，第4孔中加入磁棒套，第5孔中加入洗涤液1，第6孔中加入洗涤液1，第7孔中加入洗涤液2，第8孔中加入洗涤液2，第9孔中加入洗脱液；

20、首先取第4孔中的磁棒套，之后浸入第1孔中混合8分钟，温度55℃，之后浸入第2孔中混合8分钟，温度55℃，之后浸入第3孔中混合8分钟，温度55℃，之后浸入第5孔中混合2分钟，室温，之后浸入第6孔中混合2分钟，室温，之后浸入第7孔中混合1分钟，室温，之后浸入第8孔中混合1分钟，室温，等待3分钟后，浸入第9孔中混合3分钟，温度65℃，最后弃去磁珠，将所得洗脱液进行qpcr检测。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

22、本发明通过相对于较常用的聚乙二醇沉淀法、铝盐絮凝沉淀法、离心超滤法和0.45 µm过滤法富集、提取水体中的病毒核酸，本发明可以实现在较短时间内对水体中的病毒核酸进行提取，且整个实验操作流程操作便捷，对于不同病毒在不同类型的水体样本中，本发明均可进行有效提取，且提取效果稳定，相对于聚乙二醇沉淀法、铝盐絮凝沉淀法、离心超滤法等水体病毒核酸富集、提取方法更优异，灵敏度更高，检出率能达到100%。此外，本发明设计的试剂盒还能对水体中的病毒核酸直接提取，方便快捷高效。而且所述试剂盒不仅能对新型冠状病毒（corona virus disease 2019，covid-19）、猴痘病毒（mpox virus，mpxv）提取，还能适用于甲型流感病毒、乙型流感病毒或天花病毒等所有病毒核酸的提取，适用范围广。