一种耐药细胞株及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物医药，尤其涉及一种耐药细胞株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、结直肠癌，又称大肠癌或结肠直肠癌，是起源于结肠或直肠的恶性肿瘤。结直肠是消化系统的一部分，位于腹部，负责吸收水分和营养物质，并排泄废物。结直肠癌通常发展缓慢，开始时可能形成小的非恶性肿块，称为腺瘤，在多年的时间里逐渐演变为癌症。导致结直肠癌的具体原因尚不完全清楚，但一些因素与其发病风险相关，包括年龄、家族史、饮食习惯(高脂肪、低纤维饮食)、肥胖、吸烟、酗酒以及某些遗传病变(如家族性腺病息肉症)。

2、结直肠癌的治疗方法因患者的具体情况而异，可能会采用以下一种或多种治疗方式：(1)手术切除：手术是最常见且最有效的治疗结直肠癌的方法。根据肿瘤的位置和阶段，可以进行局部切除(适用于早期癌症)或全结肠切除(适用于进展较大的癌症)。(2)化疗：化学药物通过杀死或阻止癌细胞生长来治疗结直肠癌。化疗可以在手术前(新辅助化疗)或手术后(辅助化疗)进行，也可以用于晚期结直肠癌的控制病情。(3)放疗：放射线通过定向高能射线杀死癌细胞或抑制其生长。放疗通常与手术或化疗联合使用，可用于减小肿瘤体积、预防复发或缓解疼痛症状。(4)靶向治疗：靶向治疗指针对特定的分子靶点，使用特定的药物阻断癌细胞生长和扩散。这些药物可以是抗vegf药物(抑制血管生成)或egfr抑制剂(抑制肿瘤细胞增殖)等。(5)免疫疗法：免疫疗法通过激活患者自身的免疫系统来对抗癌症。免疫检查点抑制剂(如pd-1抑制剂、ctla-4抑制剂)可以阻断癌细胞对免疫系统的抑制，增强机体免疫应答。其治疗方案的选择将取决于患者的癌症分期、肿瘤特征、全身健康状况以及其他个体化因素。因此，建议患者与医生进行详细的讨论和评估，以确定适合自己病情的最佳治疗方案。

3、瑞戈非尼(regorafenib)，是一种口服的多靶点络氨酸激酶抑制剂，用于治疗转移性结直肠癌的靶向药物，能够阻断涉及肿瘤生长和进展过程中的多种激酶，包括涉及血管形成、肿瘤形成和肿瘤微环境的激酶。瑞戈非尼的化学式为：c21h15clf4n4o3·h2o，其结构式为：

4、

5、随着瑞戈非尼在三线治疗中的广泛应用，及其在二线治疗中的逐步推进，瑞戈非尼的耐药问题值得进一步关注。获得性耐药是任何药物，包括新上市的药物，在长期应用后都无法避免的问题，也是需要正面直视并解决的新问题。

6、瑞戈非尼的耐药性可以发生在一部分患者身上，这意味着他们的肿瘤对该药物的效果减弱或完全失去反应。耐药性发生的具体机制尚不完全清楚，但有一些常见的机制和影响因素：

7、(1)细胞信号通路变异：结直肠癌细胞内部的信号通路异常可能导致瑞戈非尼的治疗效果下降。这可能包括ras突变、braf突变以及其他与细胞增殖和存活有关的基因异常。(2)药物代谢和排泄：患者个体差异在药物代谢和排泄方面可能起着作用，影响药物在体内的浓度和持续时间。这可能导致瑞戈非尼的疗效降低或耐药性的发展。(3)肿瘤微环境：肿瘤微环境中的各种细胞和分子可以与药物相互作用，影响药物的疗效。例如，减少药物在肿瘤内的浓度、提供保护性的途径或促进耐药性的分子信号。

8、研究发现pi3k/akt通过介导的pi3kca突变可能与瑞戈非尼耐药相关，拮抗igf-1r可以抑制结直肠癌对瑞戈非尼的耐受性、抑制其干性，为临床上克服瑞戈非尼耐受提供了潜在靶点。

9、因此，虽然现有技术已经揭示了pi3k/akt途径和igf-1r的抑制对于克服瑞戈非尼耐受性的潜力，但目前的治疗方法中仍然存在耐药性机理不清楚的缺陷。因此，需要一种基于人结肠癌的瑞戈非尼的耐药细胞株进一步研究和改进治疗策略，如进行多靶点的联合治疗、解决治疗反应不一致性等，以提高瑞戈非尼治疗的有效性和耐受性，为患者带来更好的临床疗效。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种耐药细胞株，保藏编号为cctccno:c2023187；

2、所述耐药细胞株为针对人结直肠癌的瑞戈非尼的耐药细胞株。

3、为解决上述问题，本发明提供耐一种耐药细胞株的构建方法，采用逐步增加药物浓度法，诱导人结肠癌细胞在由低浓度至高浓度的瑞戈非尼中生长传代，即得到所述耐药细胞株。

4、优选地，所述采用逐步增加药物浓度法，诱导人结肠癌细胞在由低浓度至高浓度的瑞戈非尼环境中生长传代，即得到所述耐药细胞株，包括：

5、取人结肠癌细胞，进行初始培养环境培养，得到初始培养液；

6、利用瑞戈非尼对所述初始培养液进行诱导，调整所述初始培养液中细胞株，依次在0.2μm-10μm的梯度增加浓度下的瑞戈非尼中生长传代，得到目标细胞株；

7、将所述目标细胞株在瑞戈非尼的终浓度下重复培养，即得到稳定细胞株，并将所述稳定细胞株作为所述耐药细胞株。

8、优选地，所述取人结肠癌细胞，进行初始培养环境培养，得到初始培养液，包括：

9、取对数生长的人结肠癌细胞，接种在胎牛血清培养液中，并初始培养环境中进行培养得到所述初始培养液；

10、其中，所述初始培养环境为37℃且5％的co2饱和湿度培养箱中。

11、优选地，所述利用瑞戈非尼对所述初始培养液进行诱导，调整所述初始培养液中细胞株，依次在0.2μm-10μm的梯度增加浓度下的瑞戈非尼中生长传代，得到目标细胞株，包括：

12、对所述初始培养液的细胞株中所加入瑞戈非尼进行低浓度诱导至1μm浓度，获得低浓度细胞培养液；

13、将所述低浓度细胞培养液中加入瑞戈非尼进行中浓度诱导至4μm浓度，获得中浓度细胞培养液；

14、将所述中浓度细胞培养液中加入瑞戈非尼进行高浓度诱导至10μm浓度，获得所述目标细胞株。

15、优选地，所述对所述初始培养液的细胞株中所加入瑞戈非尼进行低浓度诱导至1μm浓度，获得低浓度细胞培养液，包括：

16、在所述初始培养液中，加入瑞戈非尼和oct3/4诱导剂o4i2，并且保持初始浓度为0.2μm；其中，所述oct3/4诱导剂o4i2的加入量为0.01μm；

17、待所述初始培养液中细胞生长时，以每次0.2μm浓度调整其中瑞戈非尼，使其浓度递增，直至达到1μm浓度下且细胞能够生长和传代，即得到所述低浓度细胞培养液。

18、优选地，所述将所述低浓度细胞培养液中加入瑞戈非尼进行中浓度诱导至4μm浓度，获得中浓度细胞培养液，包括：

19、在所述低浓度细胞培养液中，加入瑞戈非尼和oct3/4诱导剂o4i2，并且保持其中瑞戈非尼浓度稳定于1μm一周；其中，所述oct3/4诱导剂o4i2的加入量为0.01μm；

20、以每次1μm浓度调整其中瑞戈非尼，使其浓度递增，直至达到4μm浓度下且细胞能够生长和传代，即得到所述中浓度细胞培养液。

21、优选地，所述将所述中浓度细胞培养液中加入瑞戈非尼进行高浓度诱导至10μm浓度，获得所述目标细胞株，包括：

22、在所述中浓度细胞培养液中，保持其中瑞戈非尼浓度稳定于4μm一周；

23、以每次2μm浓度调整其中瑞戈非尼，使其浓度递增，直至达到4μm浓度下且细胞能够生长和传代，即得到所述高浓度细胞培养液，即得到所述目标细胞株。

24、优选地，所述将所述目标细胞株在瑞戈非尼的终浓度下重复培养，即得到稳定细胞株，并将所述稳定细胞株作为所述耐药细胞株，包括：

25、将所述目标细胞株于液氮中冻存2周，得到第一冻存细胞株；

26、取出所述第一冻存细胞株，采用10μm的终浓度的瑞戈非尼培养1周，得到第一培养细胞株；

27、将所述第一培养细胞株再次置于液氮中冻存2周，得到第二冻存细胞株；

28、将所述第二冻存细胞株，再次采用10μm的终浓度的瑞戈非尼培养1周，得到稳定细胞株，作为所述耐药细胞株。

29、此外，为解决上述问题，本发明还提供一种如是上述所述耐药细胞株，或者如是上述所述方法构建的所述耐药细胞株，在制备防治人结直肠癌的产品的应用，所述产品包括药物、检测试剂和检测试剂盒。

30、本发明提供本发明提供一种耐药细胞株及其构建方法和应用，所述耐药细胞株的保藏编号为cctcc no:c2023187；所述耐药细胞株为针对人结直肠癌的瑞戈非尼的耐药细胞株。本发明以结肠癌细胞ht-29为对象，通过(体外)逐步增加药物浓度法构建相应的耐药细胞株ht-29/bay，为瑞戈非尼耐药机制研究与相关靶点的开发提供了基础。