类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素的生产的制作方法

本发明属于类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoid)领域，特别地，本发明涉及用于生产脱辅基类胡萝卜素和类胡萝卜素的改进方法。

背景技术：

1、类胡萝卜素是在许多植物、藻类和某些细菌和真菌中合成的一类天然产物。类胡萝卜素具有许多不饱和碳结合，这些结合是共轭的，这促成不同的特征、明亮的颜色(范围从淡黄色到橙色到红色)和有效的抗uv和抗氧化作用。由于这些特征，类胡萝卜素已被广泛用作天然色素和营养制品(nutraceutical)。特别地，八氢番茄红素(phytoene)具有有效的uvb吸收能力并减少人类皮肤中的黑色素合成，因此在化妆品中具有日益增长的市场。番茄红素、β-胡萝卜素和α-胡萝卜素因其抗氧化剂作用而众所周知，并已被广泛用于食品、化妆品、营养制品和动物饲料产品中。

2、脱辅基类胡萝卜素是通过类胡萝卜素裂解加氧酶衍生自类胡萝卜素的一类化合物。脱辅基类胡萝卜素广泛分布于细菌、真菌、植物和动物中，作为香味(aroma)和气味(scent)化合物(α-紫罗酮和β-紫罗酮)、感光色素(胭脂树素、藏红花素)、激素(脱落酸)和信号传导化合物(独脚金内酯)起作用。在各种脱辅基类胡萝卜素中，α-紫罗酮和β-紫罗酮是两种重要的芳香族化合物。α-紫罗酮具有甜的且紫罗兰样香味，气味阈值为～0.4ppb。其异构体，β-紫罗酮具有温暖、木质且紫罗兰的香味和甚至更低的气味阈值，在空气中为～0.007ppb且在水中为1ppb。由于它们的显著低的气味阈值和令人愉快的气味，它们被广泛用于化妆品和香料工业中。除紫罗酮之外，视黄醇(或维生素a)是另一种商业上重要的脱辅基类胡萝卜素。视黄醇作为抗氧化剂在视力、骨发育和皮肤健康方面发挥至关重要的作用。作为活性化妆品成分和皮肤疾病的有效药物，视黄醇的市场规模估计为约16亿美元。

3、尽管它们具有高的商业价值，天然紫罗酮和类视黄醇(retinoid)的供给受到其在自然界中的极其低的丰度的严重限制。紫罗酮以亚ppm(sub-ppm)水平在许多花和果实例如玫瑰、桂花、鸢尾根和覆盆子中存在。例如，生产仅1克α-紫罗酮就需要100吨覆盆子或20公顷的农业面积。对于类视黄醇，则不存在来自植物的天然来源。一些动物来源的食物例如鸡蛋和黄油中存在极低量的类视黄醇。因此，目前通过从天然来源提取的供给不能够满足对天然紫罗酮和类视黄醇的日益增长的需求。尽管这些化合物可以进行化学合成，但是脱辅基类胡萝卜素诸如α-紫罗酮具有手性中心，而合成的化合物则通常是不同对映体的混合物。已知许多香料(fragrance)化合物的不同异构体具有不同的气味，因此合成单一异构体而不是异构体混合物是重要的。更重要的是，消费者倾向于喜欢天然香料胜过合成香料，并因此天然成分具有显著更高的价格。α-紫罗酮的生产先前在工程化的大肠杆菌(escherichia coli)中被证明，但产率非常低。

4、因此，对以提高的产率提供天然地生产的化合物存在需求。

技术实现思路

1、在一方面，提供了生产类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达包含表达载体的表达模块的步骤，所述表达载体具有编码至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶的编码区，所述编码区与启动子可操作地连接。

2、在一方面，提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体具有编码至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶的编码区，所述编码区与启动子可操作地连接。

3、在一方面，提供了试剂盒，所述试剂盒在如本文所描述的方法中使用时用于生产类胡萝卜素，所述试剂盒包含以下的一种或更多种：第一载体，所述第一载体编码选自atob、hmgs、thmgr的一种或更多种优化的第一基因产物；第二载体，所述第二载体编码选自mevk、pmk、pmd或idi的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第二基因产物；第三载体，所述第三载体编码选自ispa、crte或crtb、任选地crti的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第三基因产物，其用于生产八氢番茄红素或番茄红素。

4、在一方面，提供了用于生产类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的系统，所述系统包括表达载体，所述表达载体具有编码至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶的编码区，所述编码区与启动子可操作地连接，其中所述至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶选自：a.用于生产α-紫罗酮的δn50-lslcye和trxa-ccd1(优选trxa-桂花(osmanthus fragans)ccd1)；或b.用于生产β-紫罗酮的crty和ccd1(优选矮牵牛(petunia hybrid)ccd1)；或c.用于生产ε-胡萝卜素的δn50-lslcye；或d.用于生产视黄醛或视黄醇的crty和blh。

5、在一方面，提供了试剂盒，所述试剂盒在如本文所描述的方法中使用时用于生产类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素，所述试剂盒包含以下的一种或更多种：第一载体，所述第一载体编码选自atob、hmgs、thmgr和任选地crty的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第一基因产物；第二载体，所述第二载体编码选自mevk、pmk、pmd或idi的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第二基因产物；第三载体，所述第三载体编码选自ispa、crte、crtb或crti的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第三基因产物；和第四载体，所述第四载体编码选自以下的一种或更多种优化的基因产物：a.用于生产α-紫罗酮的与启动子可操作地连接的δn50-lslcye和trxa-桂花ccd1；或b.用于生产β-紫罗酮的与启动子可操作地连接的crty和phccd1；或c.用于生产ε-胡萝卜素的与启动子可操作地连接的δn50-lslcye；或d.用于生产视黄醛或视黄醇的与启动子可操作地连接的crty和blh。

6、在一方面，用于生产类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的方法，所述方法包括以下步骤：a.在化学成分确定的培养基(chemically defined media)中使如本文描述的宿主细胞与用于脱辅基类胡萝卜素或类胡萝卜素生产的底物接触；b.在所述化学成分确定的培养基中孵育宿主细胞以产生一种或更多种预先选择的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素；和c.使用有机层从化学成分确定的培养基中提取一种或更多种预先选择的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素。

7、具体地，本发明提供了以下方案：

8、1.一种用于生产类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的方法，所述方法包括以下步骤：在宿主细胞中表达包含表达载体的表达模块，所述表达载体具有编码至少一种优化的脱辅基类胡萝卜素或类胡萝卜素生成酶的编码区，所述编码区与启动子可操作地连接。

9、2.根据项目1所述的方法，其中所述类胡萝卜素选自八氢番茄红素、番茄红素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素或β-胡萝卜素，并且其中所述脱辅基类胡萝卜素选自α-紫罗酮、β-紫罗酮、假性紫罗酮(或ψ-紫罗酮)、羟基紫罗酮、β-环柠檬醛、反式香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮(mho)、视黄醛、视黄醇、8’,10-二阿朴胡萝卜素-8’,10-二醛(c17)或10’,6-二阿朴胡萝卜素-10’,6-二醛(c19)。

10、3.根据项目1或2所述的方法，其中所述至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶选自crty、ccd1、ccd2、ccd4、bcdo、lcye、blh或ybbo。

11、4.根据项目3所述的方法，其中所述ccd2选自caccd2或csccd2。

12、5.根据项目3所述的方法，其中所述ccd4选自由以下组成的组：atccd4、boccd4b、cmccd4、csccd4a、maccd4、mdccd4、ofccd4、ppccd4、rdccd4和vvccd4a。

13、6.根据项目2或项目3所述的方法，其中所述脱辅基类胡萝卜素是α-紫罗酮，并且其中所述至少一种优化的脱辅基类胡萝卜素生成酶选自lcye和ccd1，并形成具有以下结构的操纵子：lcye-ccd1。

14、7.根据项目6所述的方法，其中所述lcye源自莴苣(lactuca sativa)并且是n-末端截短的(范围为lslcye的1至100个氨基酸，特别是δn50-lslcye)。

15、8.根据项目6所述的方法，其中所述ccd1被表达为选自trxa-ccd1、sumo-ccd1或mbp-ccd1的融合蛋白。

16、9.根据项目8所述的方法，其中所述融合蛋白是trxa-ccd1。

17、10.根据项目9所述的方法，其中融合蛋白选自trxa-桂花(osmanthus fragrans)ccd1或trxa-矮牵牛(petunia hybrid)ccd1。

18、11.根据项目10所述的方法，其中所述ccd1源自或是桂花ccd1(ofccd1)并且包含以下突变中的一种或更多种：n154y、m152t、l151f。

19、12.根据项目6至11中任一项所述的方法，所述方法包括针对在24小时的时间段内达100-1000mg/l的量的α-紫罗酮表达水平进行筛选。

20、13.根据项目2或项目3所述的方法，其中所述脱辅基类胡萝卜素是β-紫罗酮，并且其中所述至少一种优化的脱辅基类胡萝卜素生成酶选自crty和ccd1，并形成具有结构crty-ccd1的操纵子。

21、14.根据项目13所述的方法，其中所述ccd1源自矮牵牛(phccd1)。

22、15.根据项目13所述的方法，其中所述crty源自菠萝泛菌(pantoea ananatis)。

23、16.根据项目13至15中任一项所述的方法，所述方法还包括针对在24小时的时间段内达10-1000mg/l的量的β-紫罗酮表达水平进行筛选。

24、17.根据项目2或项目3所述的方法，其中所述脱辅基类胡萝卜素是视黄醛，并且其中所述至少一种优化的脱辅基类胡萝卜素生成酶选自crty和blh，并形成具有结构crty-blh的操纵子。

25、18.根据项目17所述的方法，其中所述crty源自菠萝泛菌。

26、19.根据项目17所述的方法，其中所述blh源自未培养海洋细菌hf10_19p19。

27、20.根据项目17至19所述的方法，所述方法还包括针对在24小时的时间段内达10-1000mg/l的量的视黄醛表达水平进行筛选。

28、21.根据项目2或项目3所述的方法，其中所述类胡萝卜素是ε-胡萝卜素,并且其中所述至少一种优化的类胡萝卜素生成酶是lcye。

29、22.根据项目21所述的方法，其中所述lcye源自莴苣并且是n-末端截短的(δn50-lslcye)。

30、23.根据项目21至22中任一项所述的方法，所述方法还包括针对在24小时的时间段内达10-1000mg/l的量的ε-胡萝卜素表达水平进行筛选。

31、24.根据项目2所述的方法，其中所述类胡萝卜素是八氢番茄红素。

32、25.根据项目24所述的方法，所述方法还包括针对在24小时的时间段内达10-1000mg/l的量的八氢番茄红素表达水平进行筛选。

33、26.根据项目1至25中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述宿主细胞中表达：第一表达模块，所述第一表达模块包含具有第一编码区的表达载体，所述第一编码区编码选自atob、hmgs、thmgr和任选的crty的一种或更多种优化的第一基因产物，所述第一编码区与启动子可操作地连接；第二表达模块，所述第二表达模块包含具有第二编码区的表达载体，所述第二编码区编码选自mevk、pmk、pmd或idi的一种或更多种优化的第二基因产物，所述第二编码区与启动子可操作地连接；第三表达模块，所述第三表达模块包含具有第三编码区的表达载体，所述第三编码区编码选自ispa、crte、crtb或crti的一种或更多种优化的第三基因产物，所述第三编码区与启动子可操作地连接。

34、27.根据项目26所述的方法，其中所述一种或更多种第一基因产物形成具有以下结构的操纵子：atob-hmgs-thmgr。

35、28.根据项目26所述的方法，其中所述一种或更多种第一基因产物形成具有以下结构的操纵子：crty-atob-hmgs-thmgr。

36、29.根据项目26所述的方法，其中所述一种或更多种第二基因产物形成具有以下结构的操纵子：mevk-pmk-pmd-idi。

37、30.根据项目26所述的方法，其中所述一种或更多种第三基因产物形成具有以下结构的操纵子：crte-crtb-ispa。

38、31.根据项目26所述的方法，其中所述一种或更多种第三基因产物形成具有以下结构的操纵子：crte-crtb-crti-ispa。

39、32.根据项目1至31中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是选自bl21 de3或mg1655 de3的大肠杆菌(escherichia coli)。

40、33.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中所述启动子选自tm1、tm2或tm3、t7rna聚合酶启动子、t5 rna聚合酶启动子、t3 rna聚合酶启动子、sp6 rna聚合酶启动子或诱导型启动子中的一种或更多种。

41、34.根据项目1至33中任一项所述的方法，其中所述脱辅基类胡萝卜素生成酶的优化和优化的基因产物通过密码子优化或定点诱变实现。

42、35.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含表达模块，所述表达模块包含表达载体，所述表达载体具有编码至少一种优化的脱辅基类胡萝卜素或类胡萝卜素生成酶的编码区，所述编码区与启动子可操作地连接。

43、36.根据项目35所述的宿主细胞，其中所述至少一种优化的脱辅基类胡萝卜素生成酶选自crty、ccd1、ccd2、ccd4、bcdo、lcye、blh或ybbo。

44、37.根据项目36所述的宿主细胞，其中所述优化的基因产物选自由以下组成的组：δn50-lslcye和trxa-桂花ccd1；crty和phccd1；δn50-lslcye；crty和blh；以及crty、blh和ybbo。

45、38.根据项目37所述的宿主细胞，其中所述桂花ccd1包含以下突变中的一种或更多种：n154y、m152t、l151f。

46、39.根据项目26至38中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞还包含：

47、第一表达模块，所述第一表达模块包含具有第一编码区的表达载体，所述第一编码区编码选自atob、hmgs、thmgr和任选的crty的一种或更多种优化的第一基因产物，所述第一编码区与启动子可操作地连接；

48、第二表达模块，所述第二表达模块包含具有第二编码区的表达载体，所述第二编码区编码选自mevk、pmk、pmd或idi的一种或更多种优化的第二基因产物，所述第二编码区与启动子可操作地连接；

49、第三表达模块，所述第三表达模块包含具有第三编码区的表达载体，所述第三编码区编码选自ispa、crte、crtb或crti的一种或更多种优化的第三基因产物，所述第三编码区与启动子可操作地连接。

50、40.根据项目26至39中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自bl21de3或mg1655 de3的大肠杆菌。

51、41.一种载体，所述载体编码选自atob、hmgs、thmgr和任选的crty的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的基因产物。

52、42.一种载体，所述载体编码选自mevk、pmk、pmd或idi的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的基因产物。

53、43.一种载体，所述载体编码选自ispa、crte、crtb或crti的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的基因产物。

54、44.一种载体，所述载体编码选自crty、ccd1、bcdo、lcye、blh或ybbo的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的基因产物。

55、45.根据项目44所述的载体，其中所述优化的基因产物选自由以下组成的组：δn50-lslcye和trxa-桂花ccd1；crty和phccd1；δn50-lslcye；crty和blh；以及crty、blh和ybbo。

56、46.根据项目45所述的载体，其中所述桂花ccd1包含以下突变中的一种或更多种：n154y、m152t、l151f。

57、47.一种系统，所述系统用于生产类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素，所述系统包括表达模块，所述表达模块包含表达载体，所述表达载体具有编码至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶的编码区，所述编码区与启动子可操作地连接，其中所述至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶选自：

58、a.用于生产α-紫罗酮的δn50-lslcye和trxa-桂花ccd1；或

59、b.用于生产β-紫罗酮的crty和phccd1；或

60、c.用于生产ε-胡萝卜素的δn50-lslcye；或

61、d.用于生产视黄醛的crty和blh；或

62、e.用于生产视黄醇的crty、blh和ybbo。

63、48.根据项目47所述的系统，所述系统还包括：

64、第一表达模块，所述第一表达模块包含具有第一编码区的表达载体，所述第一编码区编码选自atob、hmgs、thmgr和任选的crty的一种或更多种优化的第一基因产物，所述第一编码区与启动子可操作地连接；

65、第二表达模块，所述第二表达模块包含具有第二编码区的表达载体，所述第二编码区编码选自mevk、pmk、pmd或idi的一种或更多种优化的第二基因产物，所述第二编码区与启动子可操作地连接；

66、第三表达模块，所述第三表达模块包含具有第三编码区的表达载体，所述第三编码区编码选自ispa、crte、crtb或crti的一种或更多种优化的第三基因产物，所述第三编码区与启动子可操作地连接。

67、49.一种试剂盒，所述试剂盒在根据项目1至34中任一项所述方法中使用时用于生产脱辅基类胡萝卜素或类胡萝卜素，所述试剂盒包含以下的一种或更多种：

68、第一载体，所述第一载体编码选自atob、hmgs、thmgr和任选的crty的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第一基因产物；

69、第二载体，所述第二载体编码选自mevk、pmk、pmd或idi的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第二基因产物；

70、第三载体，所述第三载体编码选自ispa、crte、crtb或crti的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第三基因产物；和

71、第四载体，所述第四载体编码选自以下的一种或更多种优化的基因产物：

72、a.用于生产α-紫罗酮的与启动子可操作地连接的δn50-lslcye和trxa-桂花ccd1；或

73、b.用于生产β-紫罗酮的与启动子可操作地连接的crty和phccd1；或

74、c.用于生产ε-胡萝卜素的与启动子可操作地连接的δn50-lslcye；或

75、d.用于生产视黄醛的与启动子可操作地连接的crty和blh；或

76、e.用于生产视黄醇的crty、blh和ybbo。

77、50.一种用于生产类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的方法，所述方法包括以下步骤：

78、a.在化学成分确定的培养基中使根据项目35至40中任一项所述的宿主细胞与用于类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生产的底物接触；

79、b.在所述化学成分确定的培养基中孵育所述宿主细胞以产生一种或更多种预先选择的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素；和

80、c.使用有机层从所述化学成分确定的培养基中提取所述一种或更多种预先选择的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素。

81、51.根据项目50所述的方法，其中所述有机层是椰子油或大豆油。

82、52.根据项目50或51所述的方法，其中所述脱辅基类胡萝卜素选自α-紫罗酮、β-紫罗酮、假性紫罗酮(或ψ-紫罗酮)、羟基紫罗酮、β-环柠檬醛、反式香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮(mho)、视黄醛、视黄醇、8’,10-二阿朴胡萝卜素-8’,10-二醛(c17)或10’,6-二阿朴胡萝卜素-10’,6-二醛(c19)，并且其中所述类胡萝卜素选自八氢番茄红素、番茄红素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素或β-胡萝卜素。

83、53.一种试剂盒，所述试剂盒在根据项目1至34中任一项所述的方法中使用时用于生产类胡萝卜素，所述试剂盒包含以下的一种或更多种：第一载体，所述第一载体编码选自atob、hmgs、thmgr的一种或更多种优化的第一基因产物；第二载体，所述第二载体编码选自mevk、pmk、pmd或idi的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第二基因产物；第三载体，所述第三载体编码选自ispa、crte或crtb、任选地crti的与启动子可操作地连接的一种或更多种优化的第三基因产物，其用于生产八氢番茄红素或番茄红素。

84、定义

85、如本文所使用的，术语“编码区”，也称为编码序列或cds(来自编码dna序列)，是编码蛋白的由外显子组成的dna或rna的部分。

86、如本文所使用的，“操纵子(operon)”是指作为单个转录单位起作用的基因或dna区段的组。它可以包含操纵基因(operator)、启动子和一个或更多个被转录为一个多顺反子mrna的结构基因。