一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法与流程

本技术涉及干细胞，具体涉及一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法。

背景技术：

1、软骨(cartilage)是由软骨细胞和软骨基质组成的骨组织，是指大致形成关节的一部分的组织。软骨细胞(chondrocyte)具有合成和分泌基质与纤维的功能，起到构成关节软骨并保持其的作用。

2、软骨一旦受损就很难再生；并且，软骨是无血管组织，不存在用于提供营养的血管，干细胞的迁移受到限制，组织的再生能力降低。因此，为了软骨的再生，正进行多种再生医学研究用于提高软骨的再生能力，如诱导软骨细胞的分化。

3、目前，曾有文献报道ipsc具有向软骨细胞分化的潜能，但其采用骨形态发生蛋白作为诱导剂，价格昂贵，且操作系统重复性较差，诱导体系过于复杂。因此，需要开发全新的方法，将ipsc细胞分化为全功能的软骨细胞。

技术实现思路

1、为了克服现有技术不足，提供一种制作容易，简便易行的方法将ipsc分化为软骨细胞，本技术提供一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法。

2、一种分化培养基，以dmem/f12作为基础培养基，包括以下浓度的组分：0.8-1.6mg/l l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、0.5-1.5mg/l b27、1-3mg/l its-x、0.15-0.45mg/l非必须氨基酸、80-100umol/l 2-巯基乙醇、80-120nmol/l ttnpb、7-13umol/l chir99021、40-60mg/ll-1-抗坏血酸。

3、本技术利用特定比例l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、非必须氨基酸、2-巯基乙醇、ttnpb、l-1-抗坏血酸作为分化培养基的原料组分，用于从诱导性多功能干细胞中分化软骨细胞，处理方法操作简单，可以提高分化效率，同时获得高质量、高产率的软骨细胞。

4、本技术使用的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(glutamax)与标准l-谷氨酰胺相比，在水溶液中更稳定，不会自发降解。l-丙氨酰-l-谷氨酰胺可促进细胞逐渐释放氨基肽酶，水解二肽，缓慢释放l-丙氨酸和l-谷氨酰胺到培养基中(图1)。然后，l-谷氨酰胺和l-丙氨酸可以被细胞吸收，并用于蛋白质生产或tca循环。its-x是胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂，胰岛素(insulin)是由胰岛β细胞分泌的一种双链形式(α,β)的多肽激素，可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的吸收、脂肪的生成、一价阳离子和磷酸盐的转运、蛋白和核酸的合成，并促进细胞增殖。转铁蛋白(transferrin)是体液中不可缺少的成分，不仅参与铁的运输与代谢，参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节，还能调节铁离子平衡和能量平衡，更具有抗菌杀菌的保护功能。铁离子是细胞培养中重要的微量元素，但自由的铁离子对细胞有一定的毒性。通过饱和转铁蛋白这种形式，可以减少自由铁离子、氧自由基和过氧化氢的毒性。硒(selenium)以亚硒酸钠提供是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白的一种辅因子，在培养基中用作抗氧化剂。乙醇胺(ethanolamine)是一种重要的刺激细胞生长的化合物，是磷酯(phosphoglycerides)生物合成的前体，而磷酯在细胞膜和细胞器的结构与功能中发挥重要作用。ttnpb可适用于细胞疗法中的辅助试剂。

5、发明人在试验过程中发现使用its-a(胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸添加剂)代替its-x，诱导分化效果差。

6、本技术的发明人发现，将上述原料混合作为分化培养基，从ipsc中分化获得软骨细胞，无需添加细胞因子和生长因子以及生物材料基质如i型胶原蛋白，即可通过施加物理刺激和信号调节，对细胞产生强烈影响；进而可以通过整合素介导的信号通路促进软骨细胞的成骨分化。因此，本技术的技术方案中，利用分化培养基在调节ipsc向软骨细胞的分化中发挥积极作用，简化了操作步骤，能够促进扩大规模或利用生产线进行ipsc向软骨细胞的分化在临床中的应用。

7、优选地，所述分化培养基包括以下重量份的组分：0.8-1.2mg/l l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、1-1.5mg/l b27、1-2mg/l its-x、0.2-0.4mg/l非必须氨基酸、85-95umol/l 2-巯基乙醇、90-110nmol/l ttnpb、9-11umol/l chir99021、45-55mg/l l-1-抗坏血酸。

8、进一步地，所述分化培养基包括以下重量份的组分：1mg/l l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、1mg/l b27、2mg/l its-x、0.3mg/l非必须氨基酸、90umol/l 2-巯基乙醇、100nmol/lttnpb、10umol/l chir99021、50mg/l l-1-抗坏血酸。

9、本技术的发明人发现，分化培养基中的各成分用量对于ipsc中分化获得软骨细胞的效果具有较大的影响，本技术通过多次试验，优化了各原料的用量为上述添加量，提高了分化培养基的使用效果。

10、优选地，所述分化培养基还包括0.5-1.2mg/l的钠盐。

11、进一步地，所述钠盐为重量比为5：(1-3)的偏硅酸钠和亚硒酸钠。

12、在一个具体的实施方案中，所述偏硅酸钠和亚硒酸钠的重量比可以为5：1、5：2、5：3。

13、在一个具体的实施方案中，所述l-天冬氨酸和l-亮氨酸的重量比还可以为5：(1-2)、5：(2-3)。

14、经过试验分析可知，本技术选择在分化培养基中添加上述重量比的偏硅酸钠和亚硒酸钠作为钠盐，可以进一步提高诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的分化质量和分化效率。

15、第二方面，本技术提供了上述分化培养基在诱导多功能干细胞分化为软骨细胞中的应用。

16、第三方面，本技术提供了一种诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法，利用上述分化培养基诱导多功能干细胞，获得软骨细胞；具体包括以下步骤：

17、预处理：利用5-15um的gsk-3抑制剂对ipsc细胞进行预处理；

18、解离：利用解离液accutase对ipsc细胞进行消化，解离为分散状态的单个细胞；

19、接种与分化培养：接种时使用含有10um y27632的mtesr1对细胞在matrigel包被的孔板上进行定量接种，培养20-28h；吸出原有培养基，加入含有5-15um gsk-3抑制剂的分化培养基中进行分化培养20-28h；吸出原有培养基，再次加入含有5-15um gsk-3抑制剂的分化培养基中进行分化培养20-28h；然后吸出原有培养基，加入所述分化培养基中进行分化培养，之后每隔20-28h更换新的分化培养基，至分化培养9d经过消化、解离重悬，获得f0代软骨细胞；

20、传代培养：将所述f0代软骨细胞进行传代培养，获得成熟的软骨细胞。

21、单个的、分散状态的ipsc会比集落状态的细胞更容易响应信号刺激，进而分化效率会较高。因此，本技术的技术方案中，使用单个的、分散状态的ipsc细胞来进行分化处理，从而提高分化效率。同时，为了保证单个的、分散状态的细胞的活率，本技术中还使用了gsk-3抑制剂对细胞进行预处理。

22、优选地，所述gsk-3抑制剂为chir99021。

23、chir-99021是氨基嘧啶衍生物，可以激活wnt/β-catenin信号通路，诱导多功能干细胞的分化；通过抑制糖原合成酶激酶-3活性而促进多功能干细胞的自我更新潜能，并加强β-连环蛋白和c-myc功能的上调。通过调节转化生长因子β、notch和丝裂原活化蛋白激酶信号通路而促进诱导多功能干细胞的自我更新，并促进细胞增殖。

24、优选地所述细胞接种的接种密度为1.5×105-4×105cells/well。

25、第四方面，本技术提供了利用上述方法制得的软骨细胞。

26、综上所述，本技术具有以下有益效果：

27、本技术的方法中，使用的分化培养基通过以下机理促进分化：一方面，诱导多功能干细胞通过生物物理作用利用分化培养基贴附固定在具有相对高弹性模量高硬度的培养板表面，有利有干细胞向软骨细胞分化。另一方面，分化培养基通过与细胞表面整联蛋白相互作用，促进细胞的黏附、迁移、增殖和分化，尤其是通过激活上皮-间质转化机制来刺激细胞向软骨细胞形态分化。

28、本技术利用分化培养基，成功优化出一种成本较低、简易高效地将人ipsc分化为软骨细胞的方法；该方法克服了现有技术的不足，不涉及异种胎牛血清，无需胶原包被细胞载体，无需添加小分子化合物及生长因子，无需特殊培养条件，可以简易高效地产生大量适用于临床的ipsc来源的软骨细胞。

29、利用本技术的方法分化获得的软骨细胞方法简易，获得的软骨细胞纯度高、效率高，9d可获得第一代软骨细胞，无需要复杂操作。成本低。