可参与构建再生牙的神经嵴细胞的培养基及其诱导再生牙的培养方法

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及细胞培养基及其用途。更具体而言，本发明涉及细胞培养基及其用于培养神经嵴细胞的用途、包含所述培养基和神经嵴细胞的培养物、以及试剂盒及其用于全牙再生的用途。本发明还涉及培养躯干神经嵴细胞的方法以及由躯干神经嵴细胞实现全牙再生的方法。

背景技术：

1、牙齿的生长发育是一个连续复杂的过程。在这一过程中，神经嵴衍生的外胚间充质细胞与口腔上皮细胞相互作用形成牙胚，并进一步发育为完整的牙齿。因此，找到合适的种子细胞替代牙胚的上皮细胞和间充质细胞是实现牙齿再生的关键问题之一。自从2000年科学家发现了牙髓干细胞后，牙髓干细胞、牙周膜干细胞、骨髓干细胞均被作为取代间充质细胞的研究对象，但是这些细胞未能真正诱导非胚胎的牙源上皮或非牙源的上皮形成牙齿结构。另一方面，在牙齿萌出后，成体牙源的上皮细胞已经无从获得。因此，近年来，研究人员已经开发了多种可替代牙胚上皮细胞的种子细胞，这些上皮种子细胞可以与胚胎期牙源间充质细胞共同形成牙样结构。但是，如何获得可替代牙胚间充质细胞的成牙间充质细胞(即具有成牙潜能的，可以与牙源或非牙源性上皮共同构建牙齿的间充质细胞)，仍然是十多年来有待攻克的瓶颈问题。

2、由于颅神经嵴细胞在体内可分化为牙间充质细胞，可以成为体外牙再生的重要种子细胞。在不断的研究中，研究人员利用生物工程材料成功地将神经嵴细胞分化成成牙本质细胞或诱导神经嵴细胞分化成牙本质。牙源性间充质细胞的起源则应追溯到胚胎形成时期，该时期的神经嵴细胞向腹侧迁移，参与了全身多种组织器官的形成，特别是在头部区域，神经嵴细胞衍生为大量的间充质细胞，参与组织的形成(tan ss,morrisskay g.celltissue res,1985,240(2):403-416；santagati f,rijli fm.nat rev neurosci,2003,4(10):806-818；和gross jb,hanken j.dev biol,2008,317(2):389-400)。早期研究证明：牙胚的间充质细胞主要由发育期的神经嵴迁移分化产生[jheon ah,schneider ra.j dentres,2009,88(1):12-21；和miletich i,sharpe pt.neural crest contribution tomammalian tooth formation.birth defects research part c,embryo today:reviews,2004,72(2):200-212]。所以，通过体外获得神经嵴细胞，有望实现牙胚间充质的再生。颅面部发育时，神经嵴细胞在迁移形成过程中由于增殖性不同而形成了不同的分隔区，即为鳃弓。tralnor等研究表明：在颅面部发育早期，由后中脑和前后脑的神经外胚层细胞转变而来的颅神经嵴细胞，占据了第一鳃弓间充质的大部分区域，且定位于上下颌突内[trainorp,krumlauf r.nature cell biology,2000,2(2):96-102]。随后，相关研究进一步确定了神经嵴细胞在哺乳动物牙齿发育中的作用，研究人员将小鼠神经嵴和牙源性上皮重组并移植于小鼠前眼窝中培养，可以形成牙齿，为神经嵴在哺乳动物牙齿形成中的作用提供了直接证据。这一研究结果同时表明：牙齿发育主要来源于一系列下颌上皮和神经嵴衍生外胚间充质的上皮-间充质相互作用[thesleff i,sharpe p.mechanisms of development,1997,67(2):111-123.，和jernvall j,thesleff i.mechanisms of development,2000,92(1):19-29]。imai等的研究也显示：神经嵴来源的外胚间充质细胞产生牙源性间充质细胞，继而分化成能分泌牙本质的成牙本质细胞[imai h,osumi-yamashita n,ninomiya y,etal.devbiol,1996,176(2):151-165.]。而且神经嵴的转录因子突变会导致颅部及牙齿的发育异常[satokata i,maas r.nature genetics,1994,6(4):348-356；和peters h,neubusera,kratochwil k,et al.genes&development,1998,12(17):2735-2747]。所以，上述的研究结果均表明：神经嵴细胞对牙胚间充质的形成和牙齿器官的发育都具有着重要的意义。同时，这一研究结论对于如何从牙胚间充质的角度实现牙齿再生，也有着十分重要的指导价值。

3、神经嵴细胞在牙齿再生中的应用研究：mitsiadis等通过将小鼠胚胎神经嵴组织移植到相应时期的小鸡胚的神经嵴位置，发现小鸡胚的第一鳃弓在数日后出现了再生的牙胚结构[mitsiadis ta,cheraud y,sharpe p,et al.proceedings of the nationalacademy of sciences of the united states of america,2003,100(11):6541-6545.]。chung等以ha/tcp为支架，将鼠胚胎期10.5天的迁移后的颅神经嵴细胞和胚胎期13.5天牙胚的细胞共同移植到裸鼠皮下，发现神经嵴细胞可以生成骨髓基质并支持牙胚的发育。因此，迁移后的颅部神经嵴细胞不仅对于颅部组织的形成有着重要的意义，也在牙齿器官的发育中发挥了重要的作用[chung ih,yamazat,zhao h,et al.stem cells,2009,27(4):866-877.]。国内学者的研究也显示：颅部神经嵴经体外诱导后，可在一定程度上体现成牙本质细胞特性，与胶原-壳聚糖三维凝胶支架复合植入裸鼠背部皮下后，会有牙本质样结构生成[jiang hb,tian wd,liu lk,et al.cell biology international,2008,32(6):671-678.]。这些都说明颅部神经嵴细胞是牙齿分化及再生的理想种子细胞来源。

4、本发明成功分离并且培育了躯干部的神经嵴细胞，多次传代后可和上皮组分形成完整的牙样结构，扩展了神经嵴细胞可用于全牙再生的取材范围，提出了一种新型的可用于全牙再生的间充质性质的候选细胞。

技术实现思路

1、目前已知成功构建的再生牙均包含了牙胚来源的上皮或间充质部分，大大制约了再生牙的产出及临床转化应用。如何获得可替代牙胚间充质细胞的成牙间充质细胞(即具有成牙潜能的，可以与牙源或非牙源性上皮共同构建牙齿的间充质细胞)，仍然是实现牙齿再生的关键问题之一。牙胚间充质细胞最终发育成了牙本质、牙髓和牙周组织，其中包含有牙髓(干)细胞，牙周膜(干)细胞等成熟的牙源细胞。但，这些细胞已彻底失去了诱导无诱导成牙命运的细胞群。

2、对此，本发明成功分离培育了躯干部的神经嵴细胞，多次传代后可和上皮组分形成完整的牙样结构，扩展了神经嵴细胞可用于全牙再生的取材范围，提出了一种新型的可用于全牙再生的间充质性质的候选细胞。

3、在一个方面，本发明涉及一种细胞培养基，其为包含或添加有n2补充剂、b27补充剂、bfgf和egf的dmem/f12培养基。在所述培养基中，bfgf以1ng/μl-100ng/μl，例如5ng/μl、10ng/μl、20ng/μl、30ng/μl、40ng/μl、50ng/μl、60ng/μl、80ng/μl，优选20ng/μl的含量存在。在所述培养基中，egf以1ng/μl-100ng/μl，例如5ng/μl、10ng/μl、20ng/μl、30ng/μl、40ng/μl、50ng/μl、60ng/μl、80ng/μl，优选20ng/μl的含量存在。

4、n2补充剂和b27补充剂一般以浓缩液的形式提供并添加到本发明的细胞培养基中，例如浓缩程度可以是50×、100×或200×。以200×浓度程度为例，在所述培养基中，200×n2补充剂的含量可以为0.1％体积-1％体积，例如0.2％体积、0.3％体积、0.4％体积、0.6％体积、0.8％体积，优选0.5％体积。此外，以100×浓度程度为例，在所述培养基中，100×b27补充剂的含量可以为0.2％体积-2％体积，例如0.3％体积、0.4％体积、0.5％体积、0.6％体积、0.8％体积、1.2％体积、1.4％体积、1.5％体积、1.6％体积、1.8％体积，优选1％体积。本领域技术人员理解根据浓缩程度将合适量或含量的上述补充剂加入培养基中。

5、在一个方面，上述细胞培养基可以用于培养神经嵴细胞，例如躯干神经嵴细胞。本发明涉及所述细胞培养基用于培养躯干神经嵴细胞的用途。在该方面中，神经嵴细胞经过培养在体外扩增并维持可参与诱导成牙的能力。

6、在一个方面，本发明涉及一种细胞培养物，其包含本发明的上述细胞培养基和躯干神经嵴细胞。

7、在一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含第一细胞培养基和第二培养基，所述第一细胞培养基是包含或添加有n2补充剂、b27补充剂、bfgf和egf的dmem/f12培养基，和所述第二培养基是包含或添加有fbs的高糖dmem培养基。在第二培养基中，fbs在高糖dmem培养基中的含量可以为1％-20％，例如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、14％、15％、16％、18％，优选10％。所述试剂盒可以用于全牙再生，具体而言用于由神经嵴细胞例如躯干神经嵴细胞实现全牙再生。第一细胞培养基和第二培养基可以分别单独地放置，例如放置在单独的容器中。

8、在一个方面，本发明涉及上述试剂盒用于全牙再生的用途。在该用途中，第一细胞培养基用于培养躯干神经嵴细胞，并且第二培养基用于培养经第一培养基培养的躯干神经嵴细胞与牙胚上皮细胞或组织的混合物。

9、在一个方面，本发明涉及一种培养躯干神经嵴细胞的方法，其包括上述细胞培养基中培养躯干神经嵴细胞的步骤。本发明还可以涉及一种培养躯干神经嵴细胞以在体外扩增并维持可参与诱导成牙的能力的方法，其包括在上述细胞培养基中培养躯干神经嵴细胞以使其体外扩增并维持可参与诱导成牙的能力的步骤。在该方面中，所述细胞培养基是上述包含或添加有n2补充剂、b27补充剂、bfgf和egf的dmem/f12培养基。在培养躯干神经嵴细胞的步骤中，躯干神经嵴细胞在37℃和5％co2的条件下培养，优选孵育48小时；每两天更换一次培养基；和/或每3至4天以1:3的比例传代一次。所述方法还可以包括对p3-p5(p3、p4和/或p5)代培养的躯干神经嵴细胞进行离心收集并孵育以使细胞聚团的步骤。在该步骤中，每1.5毫升离心管1.0x 105细胞，4度离心，以6600rpm进行4分钟。在该步骤中，在37℃下孵育1-3小时以使细胞聚团。具体而言，在该步骤中，在离心后每管保留400微升，置于37度培养箱中，孵育1-3小时，促使细胞聚团。在该方面中，躯干神经嵴细胞经过培养在体外扩增并维持可参与诱导成牙的能力。

10、在一个方面，本发明涉及由躯干神经嵴细胞实现全牙再生的方法。所述方法包括a)如上文所述的培养躯干神经嵴细胞的步骤；b)使培养的躯干神经嵴细胞聚团的步骤；和c)将从步骤b)获得的细胞聚团与牙胚上皮细胞或组织重组以获得重组物的步骤。所述方法还可以包括d)将从步骤c)获得的重组物移植到宿主的步骤。在步骤a)中，培养躯干神经嵴细胞以在体外扩增并维持可参与诱导成牙的能力。在步骤a)中，使用包含或添加有n2补充剂、b27补充剂、bfgf和egf的dmem/f12培养基培养躯干神经嵴细胞。在步骤b)中，使从步骤a)中获得的细胞聚团。在步骤b)中，对p3-p5(p3、p4和/或p5)代培养的躯干神经嵴细胞进行离心收集并孵育以使细胞聚团。例如，在37℃下孵育1-3小时以使细胞聚团。在步骤c)中，重组通过以下方式实现：将所述细胞聚团与牙胚上皮细胞或组织在包含或添加有fbs的高糖dmem培养基中培养，优选在气液两相中培养过夜。fbs在高糖dmem培养基中的含量可以为1％-20％，例如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、14％、15％、16％、18％，优选10％。在步骤c)中，从哺乳动物的下颌骨中分离出磨牙胚芽，经dispase ii孵育，经含血清培养基终止消化及洗涤后，将牙胚上皮和牙胚间充质分离，以获得牙胚上皮细胞或组织。更具体而言，在步骤c)中，从哺乳动物的下颌骨中分离出磨牙胚芽，经0.75mg/ml dispaseii在37℃下孵育35分钟。在步骤d)中，获得的重组物可以移植到宿主肾包膜下。在该方面中，躯干神经嵴细胞经过培养在体外扩增并维持可参与诱导成牙的能力。

11、在一个方面，所述牙胚上皮细胞或组织是牙胚蕾状期后不具有诱导成牙能力的牙胚上皮细胞或组织。

12、在本发明的方法中，培养方法是在体外进行。

13、在本发明中，可以通过以下步骤获得躯干神经嵴细胞：将剥离周围有薄层组织的神经管及周围组织通过贴块法培养，所述神经管及其周围组织取自哺乳动物胚胎的躯干部位置；次日移除残留的组织块并持续培养；和收集贴块法爬出的躯干神经嵴细胞。在一个方面，将贴块法培养的细胞用分散酶例如1.5mg/ml分散酶消化，在37℃条件下，持续10分钟，并洗涤。洗涤后的细胞可以接种于用基质凝胶涂层的6孔板上。

14、在一个方面，躯干神经嵴细胞经过本发明培养基的培养在体外扩增并维持可参与诱导成牙的能力。

15、在本发明中，细胞或组织可以来源于哺乳动物。宿主可以是哺乳动物。所述细胞、组织和宿主可以来源于同一种哺乳动物。哺乳动物可以是牛、羊、猪、犬、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或猴。

16、在本文中，“n2补充剂”或“n2添加剂”基于bottenstein’s n-1配方，是一种化学成分确定的无血清添加剂。n2补充剂可用于支持源自外周神经系统和中枢神经系统的原代神经母细胞瘤及有丝分裂后神经元的生长和表达。n2补充剂可以gibco，17502-048市售。

17、在本文中，“b27补充剂”或“b27添加剂”是最常被引用的神经元细胞培养补充剂，是一种优化的无血清补充剂，用于支持胚胎、产后和成人海马和其他中枢神经系统神经元的低密度或高密度生长以及短期或长期活力。b27补充剂可以以gibco，17504-044市售。

18、“bfgf”是指碱性成纤维细胞生长因子。“egf”是指表皮生长因子。“fbs”是指胎牛血清。

19、“dmem/f12培养基”全称为“(dulbecco's modified eagle medium/nutrientmixture f-12培养基”，是dmem培养基与f12培养基按照1:1比例混合所制备的培养基。在一个实例中，混合所制备的培养基可以含有l-谷氨酰胺和羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)。例如该dmem/f12培养基可以以hyclone,sh30023.01市售。

20、“dmem培养基”也称为“dulbecco's modified eagle medium”或者“dulbecco改良eagle培养基”是一种广泛使用的基础培养基，用于支持许多不同哺乳动物细胞的生长。dmem培养基含各种氨基酸和葡萄糖，是在mem培养基的基础上研制的。

21、“高糖dmem培养基”是指葡萄糖含量为约4500mg/l的dmem培养基。

22、在本发明中，当提及细胞培养和传代时，p代表传代数。例如，p3-p5是指第3代至第5代细胞。

23、与无脊椎动物相比，脊椎动物具有更先进的生理结构和更复杂的生理功能。造成这种差异的根本原因是，脊椎动物有一组可以迁移和分化的细胞，它们被称为神经嵴。神经嵴细胞可以分化为多种细胞，包括神经源性细胞、成骨细胞、黑素细胞，并在颅面结构的形成中发挥重要作用。神经嵴细胞可以分化为多种细胞，包括神经源性细胞、成骨细胞、黑素细胞，并在颅面结构的形成中发挥重要作用。由于神经嵴细胞具有多种分化潜能，它也被称为第四胚层。在胚胎第6天(e6天)，发育中的脊索和邻近的间充质诱导其表面的外胚层形成神经板，并逐渐闭合形成神经管。神经嵴细胞起源于神经管和表面外胚层之间，沿着胚胎的头尾和尾形成细胞带，然后逐渐经历上皮间充质转化。由于位置的不同，神经嵴细胞可分为五种类型：颅骨、心脏、迷走神经、躯干和骶骨。它们可以在信号通路的调控下进行迁移和分化，最终形成不同的组织和器官。

24、在颅面形成过程中，一小群颅神经嵴细胞在周围环境和细胞外信号的影响下可分化为牙间充质细胞。本发明预料不到地发现，躯干部的神经嵴细胞也可以分化为牙间充质细胞，并且可以与上皮组分组合共同形成包含牙釉质、牙本质和牙髓等的完整牙样结构。本发明首次证实了躯干部分的神经嵴细胞和头颈部神经嵴细胞一样，具有牙向发展潜能的命运。

25、本发明成功分离培育了躯干部的神经嵴细胞，多次传代后可和上皮组分形成完整的牙样结构，经研究发现，其可用于全牙再生的间充质性质的候选细胞，为全牙再生研究提供的新的种子细胞来源及研究新方案，有利于推动生物再生牙的构建研究。