一种精确鉴定杂交河鲀个体性别的SNP位点和引物及其方法

本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种精确鉴定杂交河鲀个体性别的snp位点和引物及其方法。

背景技术：

1、河鲀是我国重要的养殖鱼类之一，其口感鲜美，营养丰富，在亚洲市场上深受消费者喜爱。杂交河鲀具有和普通河鲀一样具有明显的性别二态性，即进入产卵期的雌性个体生长速度要快于雄性，然而产卵期的雌性个体生殖腺指数较高，接近30％的体重被具有毒性的卵巢所占据，导致可食用的部分大大减少，同时雄性个体的“白子”(精巢)因其独特的风味在市场上价值不菲，因而雄性个体的养殖效益要高于雌性，如果能够在苗种养殖早期精确鉴定出性别，则可以显著提高河鲀的养殖效益。

2、包括河鲀在内的大多数鱼类在性成熟之前无法从外观上来区分其性别，只有在性成熟之后，对处于繁殖期的鱼体挤压腹部观察精液或卵子以辨别雌雄，这种方法简单无害，但时间周期过长，对于河鲀这种需要2-3年才能性成熟的鱼类而言养殖成本过高。另外一种方法是解剖鱼体性腺对其性腺组织切片观察，该方法在幼鱼阶段就可以完成性别的精确鉴定，但会对鱼体造成不可逆的伤害，一般只用于实验室研究中。现有的两种方法均无法满足实际生产上的要求。

3、近年来随着分子生物学技术的发展，转录组测序等手段也逐渐被应用于鱼类性别特异性标记的开发。通常，不同性别的鱼类基因组会存在特殊的dna片段，这便是雌雄个体间特异的分子标记，找出这一分子标记便能够进一步开发简捷方便的性别鉴定方法，为鱼类的性别鉴定奠定基础。

4、基于性别特异位点的性别鉴定方法已经被广泛应用于鱼类育种以及性别调控研究。目前，公开的几种东方鲀属鱼类的性别鉴定方法都是根据这一原理开发而来，然而这些方法或多或少都存在着一些缺点，比如在本实验室此前开发的针对暗纹东方鲀性别鉴定的专利cn110724735b中，需要分别使用两对pcr引物进行两轮反应，同时还需要进行对不同大小的dna电泳条带进行区分，如果存在两对引物结果不一致的情况，需要重新提取模板dna重跑pcr。此类方法存在着效率低，易出错等问题，因此需要开发一种直接高效、易于区分结果的性别鉴定方法。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种精确鉴定杂交河鲀个体性别的snp位点和引物及其方法，提供了一种结果精准、鉴定时间短、易于学习的杂交河鲀遗传性别分鉴定方法。

2、技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种精确鉴定杂交河鲀个体性别的snp位点，所述snp位点的碱基序列如seq id no.1或seq id no.2所述。

3、本发明所述引物碱基序列分别如seq id no.3-4所示：

4、seq id no.3：hrm-f cctgagctcctggaaggctc。

5、seq id no.4：hrm-r agatctcccacagcagcagtgc。

6、本发明所述精确鉴定杂交河鲀个体性别的方法，包括如下步骤：提取dna模板，结合性别特异的hrm引物进行pcr扩增反应与分析，从而实现杂交河鲀遗传性别的精准鉴定，所述扩增反应在80～90分钟即可完成，产物无需进行琼脂糖凝胶电泳观察条带，直接观察溶解曲线即可区分雌雄。

7、进一步地，所述hrm反应体系包括2×hrm analysis premix、模板dna、上下游引物以及ddh2o。

8、进一步地，所述hrm反应体系为：8～10μl的2×hrm analysis premix；1～2μl的模板dna；8～10μm上下游引物各0.6～1μl；7.8～8μl的ddh2o。

9、作为优选，所述hrm反应体系为：10μl的2×hrm analysis premix；1μl的模板dna；10μm上下游引物各0.6μl；7.8μl的ddh2o。

10、所述hrm反应步骤为：95℃预变性2～3分钟；95℃变性10～15秒、60℃退火30～40秒，如此循环40～45次；high resolution melting：95℃1～2分钟；40℃1～2分钟；70℃1～2秒；90℃1～2秒。

11、作为优选，所述hrm反应步骤为：95℃预变性2分钟；95℃变性10秒、60℃退火30秒，如此循环40次；high resolution melting：95℃1分钟；40℃1分钟；70℃1秒；90℃1秒。

12、进一步地，所述hrm检测与分析：雄性杂交河鲀的溶解峰图为双峰曲线图，雌性杂交河鲀的溶解曲线图为单峰曲线图。

13、其中，所述精确鉴定杂交河鲀个体性别的方法在鉴定河鲀个体性别中的应用。

14、其中，本发明所述的精确鉴定杂交河鲀个体性别的方法在精确鉴定杂交河鲀个体性别中的应用。

15、进一步地，所述应用的过程为：对剪取的鳍条用常规dna提取试剂盒快速提取dna模板，结合性别特异的hrm引物在实时荧光定量仪器中进行hrm检测与分析，从而实现杂交河鲀遗传性别的精准鉴定，雄性个体的溶解峰图呈现双峰曲线，雌性个体则呈现单峰曲线。

16、本发明所述的精准鉴定杂交河鲀个体性别的方法，主要应用了高分辨率溶解曲线(hrm)技术，在设计引物时将位置选择在性别特异的snp位点周围，通过监测反应过程中dna序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，能够精确鉴定出序列中的纯合突变。

17、本发明通过对杂交河鲀(以红鳍东方鲀为父本、暗纹东方鲀为母本)群体中雌雄个体基因组分析获得了一个雌雄特异的snp位点，在该snp位点上下游设计引物，在一个杂交河鲀群体(取自南通河鲀养殖场)的基因组中扩增，测序，鉴定该snp位点是性别特异的。进一步通过hrm检测即可鉴定雌雄，雄性个体为双峰曲线，雌性个体为单峰曲线。

18、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

19、(1)本发明提供了一种用于精准鉴定杂交河鲀个体性别的snp位点并据此设计引物进行杂交河鲀个体性别的鉴定，结果准确，容易掌握。相较于传统的pcr检测法检测结果更加精准，无需重复实验以避免假阳性等结果，且不会出现检测结果错判的情况。

20、(2)此前发布的中国专利cn110724735b中的检测方法需要使用两对引物分别进行pcr扩增反应以相互验证，重复的pcr实验与电泳结果比对易造成检测结果的偏差，与之相比，本发明通过设计一对性别特异的hrm引物，开发出了一种可以精准鉴定杂交河鲀性别的方法。在light cycler 96实时荧光定量仪器(罗氏)跑完设定的程序之后只需要在仪器自带的软件中观察溶解峰图即可区分雌雄。溶解曲线结果为简单的“双峰”和“单峰”，呈现双峰的为雄性个体，呈现单峰的为雌性个体。鉴定方法简单高效，同时无需进行多次pcr反应，减少加样和pcr反应时间，减少了时间和实验成本，且检测结果精准、易于区分，不需要反复实验来提高鉴定准确率。

21、(3)本发明建立在能够找到性别特异的snp位点，在这个基础之上可以推广到其他鱼类中。本发明提供的实验思路具有较广的适用范围。