热稳定性提升的Phi29DNA聚合酶突变体及其在测序中的应用的制作方法

本发明属于生物，尤其涉及热稳定性提升的phi29 dna聚合酶突变体。

背景技术：

1、phi29 dna聚合酶是源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)phi29噬菌体的聚合酶，该酶属于b族dna聚合酶。phi29 dna聚合酶的晶体结构显示，除了具有一般b族dna聚合酶的保守的手掌(palm)、拇指(thumb)、手指(finger)和外切结构域(exo domain，具有3’→5’外切酶校正活性)，phi29 dna聚合酶还拥有另外两个独特的结构域：tpr1和tpr2结构域。tpr2结构域参与形成围绕下游模板dna链的狭小通道，迫使双链dna的解离；与此同时，palm、thumb、tpr1和tpr2结构域形成圆圈状结构，紧密地结合在上游模板链形成的双链dna上。phi29 dna聚合酶的结构特征赋予了其特殊的高持续合成能力、较强的链置换功能和高保真度。常应用于微量的环状dna的滚环扩增(rolling circle amplification,rca)或基因组的多重链置换扩增等恒温扩增等应用，例如华大基因测序仪的dna纳米球技术(dnananoball technology)和单细胞全基因测序技术。

2、dna纳米球技术(dnb technology)是华大基因测序仪的核心技术之一。基因组dna经过物理法或酶法片段化处理后，加上接头并环化成单链环状dna，随后使用高保真的链置换dna聚合酶，如phi29 dna聚合酶或bst dna聚合酶对单链环状dna进行滚环扩增(rollingcircle amplification,rca)，扩增产物即称为dna纳米球(dnananoball,dnb)。纳米球经过dnb装载技术固定在阵列化的硅芯片上，进行后续的上机测序。不同性质的phi29dna聚合酶突变体与底物dna的结合能力不同，扩增的dna纳米球产物在大小、均一性、分支结构、紧密度等特性上也有所不同，进而dnb装载至硅芯片上后测序的质量也不一样。phi29dna聚合酶的性质同样也影响mda(multiple displacement amplification,mda)方法扩增的单细胞全基因组的扩增效果，进而影响单细胞测序的质量，比如覆盖度(coverage)、比对率(mapping rate)、变异检测准确度和特异性等等，这些也是单细胞测序科研应用中十分关心的参数。

3、phi29 dna聚合酶是一种中温聚合酶，在65℃条件下加热10min即可失去活性。市面上一些商业化的phi29 dna聚合酶因为稳定性等原因，在诸如测序文库扩增、单细胞全基因组扩增等特殊应用中因为芯片上有效信号位点、扩增偏好性、覆盖度、变异检测评估等方面问题而难以满足试剂盒产品开发的要求。

技术实现思路

1、本发明提供了一种蛋白。

2、本发明提供的蛋白，为phi29 dna聚合酶突变体，是如下a)或b)：

3、a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123、217、224、515和474这6位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白；

4、b)所示的蛋白为将a)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有dna聚合酶活性的由a)衍生的蛋白质。

5、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123、217、224、515和474这6位中至少2位或至少3位或至少4位或至少5位或全部的氨基酸残基进行修饰，得到具有dna聚合酶活性的蛋白。

6、上述修饰为仅对phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123、217、224、515和474这6位按照上述需要修饰的位点进行修饰，除了这6位的其余氨基酸残基不变。

7、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123、217、224和515这5位中全部的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白，具体为实施例中的phi29-337。

8、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第224、515和474这3位中全部的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白，具体为实施例中的phi29-464。

9、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123和515这3位中全部的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白，具体为实施例中的phi29-414；

10、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123、217、515这4位中全部的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白，具体为实施例中的phi29-458；

11、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123、224、515这4位的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白，具体为实施例中的phi29-459；

12、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第224、474这2位的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白，具体为实施例中的phi29-463；

13、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第217、224这2位的氨基酸残基进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白，具体为实施例中的phi29-335。

14、上述蛋白中，所述修饰为氨基酸置换。

15、上述蛋白中，所述第97、123、217、224、515和474这6位点的氨基酸置换方式分别为如下：

16、第97位的甲硫氨酸置换为丙氨酸或组氨酸或赖氨酸或苏氨酸；

17、第123位的亮氨酸置换为赖氨酸或苯丙氨酸或异亮氨酸或组氨酸；

18、第217位的甘氨酸置换为谷氨酸；

19、第224位的酪氨酸置换为赖氨酸；

20、第474位的异亮氨酸置换为赖氨酸；

21、第515位的谷氨酸置换为脯氨酸或甘氨酸。

22、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97位氨基酸残基由m突变为了k，且第123位由l突变成h，第515位由e突变成p，第224位由y突变成k，第217位由g突变为e，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白。

23、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第224位氨基酸残基由y突变为了k，且第474位由i突变成k，第515位由e突变成p。

24、上述蛋白中，a)所示的蛋白为将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97位氨基酸残基由m突变为了t，且第123位由l突变成h，第515位由e突变成p。

25、上述蛋白中，所述phi29 dna聚合酶的氨基酸序列为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：

26、(ⅰ)序列表的序列2；

27、(ⅱ)与序列表的序列2所示的蛋白质具有90％以上同一性且来源于枯草芽孢杆菌的蛋白质的氨基酸残基序列；

28、(ⅲ)与序列表的序列2所示的蛋白质具有95％以上同一性且来源于枯草芽孢杆菌的蛋白质氨基酸残基序列。

29、上述蛋白中，所述蛋白质的稳定性高于所述phi29 dna聚合酶。

30、上述蛋白中，所述稳定性为热稳定性。

31、编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

32、含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。

33、上述蛋白在如下1)-11)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

34、1)作为dna聚合酶；

35、2)催化dna复制和/或催化dna扩增；

36、3)催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增；

37、4)进行dna测序或rna测序或全基因组测序；

38、5)rca建库(dna纳米球装载)；

39、6)基因组扩增覆盖度检测；

40、7)制备用于催化dna复制和/或催化dna扩增的试剂盒产品；

41、8)制备用于催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增的产品；

42、9)制备用于进行dna测序或rna测序或全基因组测序的产品；

43、10)制备用于rca建库的产品；

44、11)制备用于基因组扩增覆盖度检测的产品。

45、编码上述蛋白的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、含有所述核酸分子的重组菌或含有所述核酸分子的转基因细胞系在如下1)-10)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

46、1)催化dna复制和/或催化dna扩增；

47、2)催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增；

48、3)进行dna测序或rna测序或全基因组测序；

49、4)rca建库；

50、5)基因组扩增覆盖度检测；

51、6)制备用于催化dna复制和/或催化dna扩增的产品；

52、7)制备用于催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增的产品；

53、8)制备用于进行dna测序或rna测序或全基因组测序的产品；

54、9)制备用于rca建库的产品；

55、10)制备用于基因组扩增覆盖度检测的产品。

56、本发明另一个目的是提供一种提高phi29 dna聚合酶稳定性的方法。

57、本发明提供的方法，包括如下步骤：将phi29 dna聚合酶氨基酸序列中第97、123、217、224、515和474这6位中至少一位的氨基酸残基按照上述中的修饰方式进行修饰，其余氨基酸残基不变，得到具有dna聚合酶活性的蛋白。

58、上述方法中，所述稳定性为热稳定性。

59、本发明所述phi29 dna聚合酶既可以独立包装的dna聚合酶产品形式存在，也可包装进dna扩增试剂盒或dna测序试剂盒中。本发明通过定点突变和筛选技术，获得热稳定性得到较大提升的突变体。其中一些突变体在单细胞全基因组扩增中扩增覆盖度有了较大提高，变异检测的准确度和灵敏度有所提升，达到qiagen同类商品的同等水平；本发明中的另外一些突变体则在rca文库扩增应用中对dnb装载效果有良好的改善效果。

60、所述重组载体为在表达载体中插入所述核酸分子得到的。

61、所述表达载体具体可为pet28a(+)载体。

62、所述重组菌为将所述重组载体导入出发菌得到的菌。

63、所述出发菌可为大肠杆菌。

64、所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌bl21(de3)。

65、所述转基因细胞系可为将所述重组载体转化受体细胞获得的。所述转基因细胞系为非植物繁殖材料。

66、所述稳定性具体可为热稳定性。所述热稳定性具体可为37℃下的热稳定性。

67、所述phi29 dna聚合酶具体可为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：

68、(ⅰ)序列表的序列2所示的蛋白质；

69、(ⅱ)与序列表的序列2所示的蛋白质具有90％以上同一性且来源于枯草芽孢杆菌的蛋白质；

70、(ⅲ)与序列表的序列2所示的蛋白质具有95％以上同一性且来源于枯草芽孢杆菌的蛋白质。

71、在本发明基础上，可通过对本发明所述的突变位点的氨基酸进行饱和突变，进一步筛选出效果良好的突变体；或者在本发明所述突变体的基础上，再对本发明所包含氨基酸位点之外的其他氨基酸进行突变，获得类似的效果。本法明还可能应用的技术领域包括食品检测、病毒检测、rna检测、单细胞测序等，也有可能用于开发第三、四代测序仪技术。